利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法，该方法采用辣椒幼苗期离体带柄的功能叶作为待测样品；取胶孢炭疽病病原菌并接菌到待测样品的叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径；所述的待测样品为辣椒12～13叶幼苗期。本发明专利技术的方法步骤简单快捷、稳定可靠、重复性好，特别适用于分子标记开发，以及转基因株系等辣椒育种单株(或品系)的抗病性鉴定与遗传分析，能够很好地提高辣椒抗病性鉴定与筛选效率，加速育种进程。

【技术实现步骤摘要】
利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法
本专利技术属于蔬菜育种领域，涉及辣椒胶孢炭疽病，具体涉及一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法。
技术介绍
辣椒炭疽病(CapsicumannuumL.)是由半知菌亚门刺盘孢属(Colletotrichumspp.)内的胶孢炭疽(C.gloeosporiodes)、尖孢炭疽(C.acutatum)、辣椒炭疽菌(C.capsici)和球炭疽菌(C.coccodes)等几个种引起的全球性的真菌病害，其中普遍发生，感染严重的是胶孢炭疽病原菌，该菌寄主范围广，是危害辣椒、甜椒的主要病害之一。在高温高湿的气候条件下，特别是在热带、亚热带等辣椒主产区，该病发生较为普遍，危害时间长，经济损失大。在中国、印度、印度尼西亚、韩国等地区常导致辣椒减产30％～40％。目前生产上对于炭疽病的防治主要依靠化学杀菌剂，既浪费人力物力，又污染环境。培育和推广抗炭疽病的辣椒栽培品种，可减少使用化学杀菌剂，减少环境污染，降低辣椒的农药残留，是最经济、最有效的防治途径之一。而目前生产上抗炭疽病的品种匮乏，亟需开展抗炭疽病辣椒资源的筛选与鉴定研究。抗病性鉴定是抗性基因定位、候选基因筛选、分子标记开发，以及抗性遗传规律研究、抗性资源筛选及抗病品种选育的基础。抗病性鉴定的关键是准确地反映材料抗性水平，对辣椒炭疽病的抗性鉴定在接种方法、接种时期、接种浓度及调查时期有很大的差异。目前常用的接种鉴定方法有3种：喷雾法、悬滴法、针刺法。喷雾法：配制孢子浓度为1×106·ml-1悬浮液，均匀喷洒在幼苗的叶片上，依病害的严重度调查分级。悬滴法：将配置好的孢子悬浮液直接滴在洗净的辣椒果实表面，密闭保湿后，调查病斑直径。针刺法：采收果实洗净晾干，用微量注射器刺破果皮并注入1uL浓度为5×105·ml-1的孢子悬浮液，保湿7d后，测量病斑直径、调查发病率。上述现有这些鉴定方法耗费时间长，不能快速有效的鉴定抗病性，而且会对植株造成不可逆伤害。特别是，现有方法不适宜快速进行单株抗病性鉴定，如在辣椒抗病基因定位与分子标记开发中，采用常规BSA方法，需构建不同家系群体，或采用二代重测序技术，如QTL-Seq等都涉及需要对F2群体的单株进行抗病性鉴定；此外，对于一些可供鉴定样品较少的品系和转基因株系，现有方法亦具有很大的局限性。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于，提供一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法，解决现有技术中辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的鉴定方法效率低且局限性大的技术问题。为了解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案予以实现：一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法，该方法采用辣椒幼苗期离体带柄的功能叶作为待测样品；取胶孢炭疽病病原菌并接菌到待测样品的叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径；所述的待测样品为辣椒12～13叶幼苗期。本专利技术还具有如下技术特征：该方法具体包括以下步骤：步骤一，选择辣椒抗病品系R25为抗病对照，辣椒感病品系R24作为感病对照，选取抗病对照的辣椒种子和感病对照的辣椒种子；步骤二，将对胶孢炭疽病抗性未知的辣椒种子、抗病对照的辣椒种子和感病对照的辣椒种子分别进行培养种植；待辣椒幼苗长至12～13片真叶时，选取辣椒子叶上方生长正常、带叶柄并且充分展开的功能叶，获得抗病对照的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶、感病对照的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶和对胶孢炭疽病抗性未知的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶，均作为待测样品；步骤三，对每个待测样品用蘸饱灭菌水的棉花包裹叶柄，玻璃皿底部铺一层滤纸，用灭菌水将滤纸打湿，将叶片放在打湿的滤纸上，叶背朝上，胶孢炭疽病病原菌在PDA培养基上生长4～7天，用直径为5mm的打孔器取菌落边缘的菌块，并接菌到叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径。步骤二中，所述的培养种植过程为将辣椒种子经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃、全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于昼夜温光周期条件下进行培养，所述的昼夜温光周期条件为：相对湿度60％～80％，光照3000～4000lx，白天温度25℃～30℃，16h，夜间温度18℃，8h，培养期间浇Hoagland's营养液。步骤三中，所述的病斑直径采用十字交叉法测量，每个病斑测量两个直径，取两个直径的平均值。该方法还包括以下步骤：步骤四，根据病斑直径，按照辣椒离体叶片抗病性鉴定分级标准，统计待测样品的辣椒单株叶片级数，然后计算病情指数；步骤五，根据病情指数，然后按照单株抗病性分级标准确定待测辣椒单株的对胶孢炭疽病抗性。步骤四中，每个待测样品为3片辣椒12～13叶幼苗期离体带柄的功能叶，重复步骤三和步骤四3次，然后取病情指数的平均值作为病情指数。步骤四中，所述的辣椒离体叶片抗病性鉴定分级标准为：0级：叶片未发病；1级：0＜病斑直径≤0.50cm；3级：0.50cm＜病斑直径≤0.75cm；5级：0.75cm＜病斑直径≤1.0cm；7级：1.0cm＜病斑直径。步骤四中，所述的病情指数＝∑(各级病害指数叶片数×该病害级别值)÷(调查总叶片数×最高级值)×100；所述的最高级值指的是7级的级值7。步骤五中，所述的单株抗病性分级标准为：病情指数＜15.0为抗病品系；病情指数在15.0～45.0为耐病品系；病情指数＞45.0为感病品系。本专利技术与现有技术相比，有益的技术效果是：本专利技术的方法步骤简单快捷、稳定可靠、重复性好，特别适用于分子标记开发，以及转基因株系等辣椒育种单株(或品系)的抗病性鉴定与遗传分析，能够很好地提高辣椒抗病性鉴定与筛选效率，加速育种进程。本专利技术创制的利用离体叶片快速鉴别辣椒单株对炭疽病抗性的方法，主要通过采集植株少量的可再生叶片进行离体接菌处理，通过统计病情指数而鉴定出辣椒单株的抗病性。此法稳定可靠、重复性好，速度快，省时省力，对植株造成的创伤小，特别是解决了在辣椒基因定位、分子标记开发、珍贵种质资源以及转基因植株的抗病性鉴定过程中，需要对单株进行抗病性鉴定的问题。采用本专利技术技术，既可准确完成对辣椒单株抗病性的鉴定，又能进行鉴定株系留种与后代遗传分析，从而提高辣椒抗炭疽病育种的进程。附图说明图1是炭疽病菌接菌48小时后不同级别辣椒叶片症状示意图。图中从左到右依次为0级、1级、3级、5级、7级。以下结合附图和实施例对本专利技术的具体内容作进一步详细解释说明。具体实施方式本专利技术利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的一种方法，特别是涉及辣椒分离群体(如F2群体等)不同单株的抗病性鉴定，以及辣椒离体叶片病害等级分级体系建立的方法。该方法可以利用12～13叶幼苗期离体带柄的功能叶鉴定单株的病情指数，是一种操作简单、快速、有效鉴定大量辣椒种质资源(株系，或单株)抗炭疽病特性的方法，能极大地加快辣椒抗炭疽病分子标记的开发，以及抗炭疽病育种的进程。温度能够影响炭疽菌菌丝生长和孢子萌发，研究表明炭疽病菌丝生长的最适温度为28℃。前期，我们的试验表明，离体叶片接菌后的处理温度对病情指数有明显的影响，在22±2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法，其特征在于，该方法采用辣椒幼苗期离体带柄的功能叶作为待测样品；取胶孢炭疽病病原菌并接菌到待测样品的叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径；所述的待测样品为辣椒12～13叶幼苗期。

【技术特征摘要】
1.一种利用离体叶片快速鉴定辣椒单株对胶孢炭疽病抗性的方法，其特征在于，该方法采用辣椒幼苗期离体带柄的功能叶作为待测样品；取胶孢炭疽病病原菌并接菌到待测样品的叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径；所述的待测样品为辣椒12～13叶幼苗期。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：步骤一，选择辣椒抗病品系R25为抗病对照，辣椒感病品系R24作为感病对照，选取抗病对照的辣椒种子和感病对照的辣椒种子；步骤二，将对胶孢炭疽病抗性未知的辣椒种子、抗病对照的辣椒种子和感病对照的辣椒种子分别进行培养种植；待辣椒幼苗长至12～13片真叶时，选取辣椒子叶上方生长正常、带叶柄并且充分展开的功能叶，获得抗病对照的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶、感病对照的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶和对胶孢炭疽病抗性未知的辣椒幼苗期离体带柄的功能叶，均作为待测样品；步骤三，对每个待测样品用蘸饱灭菌水的棉花包裹叶柄，玻璃皿底部铺一层滤纸，用灭菌水将滤纸打湿，将叶片放在打湿的滤纸上，叶背朝上，胶孢炭疽病病原菌在PDA培养基上生长4～7天，用直径为5mm的打孔器取菌落边缘的菌块，并接菌到叶片背面；然后将待测样品置于28±2℃人工气候箱中，黑暗培养48h后，得到病斑样品，测量病斑样品的病斑直径。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中，所述的培养种植过程为将辣椒种子经55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃、全黑暗人工气候箱中进行催芽，经4d种子露白，播于穴盘中；然后将穴盘置于昼夜...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩振辉，孙建田，李大伟，罗德旭，李洋，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61