木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，包括如下步骤：将树舌灵芝菌株活化后，取优质菌株接种于液体菌株活化培养基中进行扩大培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；将菌丝体依次经过滤、无菌水冲洗、渗透压稳定剂冲洗后，加入巯基乙醇30mL，进行震荡处理，待菌丝断裂后，过滤，再用0.7 mol/L MgSO4溶液冲洗，离心，弃上清液取沉淀，吸干水分后，按菌丝体重量：溶壁酶酶液=1：10的比例将菌丝体沉淀和浓度为1.0%的溶壁酶酶液置于离心管中，摇匀后，酶解3.0h，过滤，获得的滤液离心后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。本发明专利技术的原生质体制备率高达9.15×10

【技术实现步骤摘要】
木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法
本专利技术涉及原生质体的制备方法，具体涉及一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法。
技术介绍
能源问题一直是全球问题，随着大量不可再生的能源被人类开采使用，能源危机已经威胁到人类的生活和社会的稳定。发掘、研究可再生能源已经成为可持续发展战略重要的待解决问题。木质纤维素是目前地球上分布最广泛、蕴藏最丰富的可再生资源，其干重比例占世界植物干重的30%～50%。目前，很多含有大量纤维素的物质被遗弃，如植物进行光合作用时产生的纤维素物质，人类因为社会活动留下的废弃物等等。在我国常见的便是农业中的稻草、秸秆等，城市中的垃圾、废纸等，这些都是丰富的可再生资源，因为其主要成分天然纤维质原料的结晶性和木质化限制了其可利用性。目前对于木质纤维素的降解方法有三种：（1）物理方法需要很多操作复杂且精细的仪器，费时费力；（2）化学方法成本较高，需要强酸、强碱、高压等条件，（3）而微生物降解具有耗能低、操作简单、污染较小和成本低等特点。对于微生物降解来说，能够降解木质纤维素的微生物有很多并且存在于自然界每一个角落，如细菌、真菌、放线菌及某些病毒。它们可以分解自然界生物质固废能源使其可以得到人们的利用，而这其中便包含纤维素，它们可以使这些生物聚合物可以得到资源化利用。而在降解木质纤维素时从效率和速率来看，真菌的效果一般远大于细菌。近年来对于丝状真菌降解木质纤维素取得了进展，如刘起丽，郭宏伟等研究得出复合菌系比单一菌系降解效果更加充分的结论。而到目前为止筛选出的降解菌株活性较低，均不能用于大规模生产，因此对丝状真菌进行诱变育种成为木质纤维素降解菌研究的主要方向。诱变育种可以提高菌种突变率在短时间获得优良的菌株，做到提高单一或几个生产性状。目前大型真菌的诱变育种多选择原生质体为试验材料，是否能够获得大量有活性的原生质体成为诱变育种中最关键的环节。因此大型真菌的原生质体的制备研究具有重大的实践价值。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，包括如下步骤：S1、菌株活化培养在超净工作台中，先将储存在试管中的树舌灵芝菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d～6d，直至菌丝长满平皿后备用；S2、优质菌株扩大培养在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打一个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎，在30℃、摇床转速为155r/min条件下培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；S3、原生质体的制备在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.7mol/L渗透压稳定剂MgSO4冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.7mol/LMgSO4冲洗，6500r/min，离心15min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸尽量吸干水分后，用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，然后按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例量取适量的浓度为1%的复合酶液，在容量为50mL的离心管中摇匀之后，32℃酶解3h，使之充分降解，再用四层擦镜纸过滤，获得的滤液转入到5mL离心管中，6500r/min，离心15min后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。进一步地，所述步骤S1中，改良PDA培养基为在液体菌株活化培养基的配方基础上加入琼脂20g加水定容至1000mL后所得。进一步地，所述步骤S2中，液体菌株活化培养基通过以下步骤制备所得：取适量大小马铃薯削皮后，准确称量200.0g，切成小块，煮沸20min后依次加入硫酸镁0.6g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，维生素B10.05g，过滤取澄清马铃薯汁，加水定容至1000mL。本专利技术以一株产漆酶树舌灵芝为试材，提供了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其原生质体制备率高达9.15×106个/mL。附图说明图1为本专利技术实施例中菌龄对原生质体制备数量的影响。图2为本专利技术实施例中酶液浓度对原生质体制备数量影响。图3为本专利技术实施例中酶解时间对原生质体数目的影响。图4为本专利技术实施例中渗透压稳定剂对原生质体数目的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例材料（1）试验菌株树舌灵芝由生物工程学院微生物实验室分离并保存。（2）培养基改良PDA培养基：在液体菌株活化培养基的配方基础上加入琼脂20g加水定容至1000mL。愈创木酚筛选培养基：用移液枪吸取0.04%愈创木酚，加入改良PDA培养基中。液体菌株活化培养基：取适量大小马铃薯削皮后，准确称量200.0g，切成小块，煮沸20min后依次加入硫酸镁0.6g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，维生素B10.05g，过滤取澄清马铃薯汁，加水定容至1000mL。试剂（1）酶制剂溶壁酶从上海源叶生物科技有限公司购买。（2）其他试剂渗透压稳定剂的配制：用精密电子天平分别准确称量KCl、MgSO4·7H2O、蔗糖和甘露醇的质量，将其溶于无菌水中定容，依次配制成质量浓度为0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的稳渗液。溶壁酶酶液的配制：称取少量不同质量的溶壁酶溶解在不同浓度渗透压稳定剂中，配制成浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的酶液，然后用孔径为0.22的微孔过滤器过滤去除杂菌备用。试验方法菌株活化培养在超净工作台中，先将储存在试管中的菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d-6d，直至菌丝长满平皿后备用。2.2产酶特性分析用打孔器沿菌丝活力好且菌丝分布均匀地方打出一个直径为5mm的菌块，用镊子将菌块分别放置到愈创木酚筛选培养基中，菌丝面朝向培养基然后进行30℃培养，24h后定期观察红色圈产生时间，同时测定红色圈直径大小，分析菌株产酶情况。2.3优质菌株扩大培养在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打十个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎。在30℃、摇床转速为155r/min条件下培养，分别选取4d、5d、6d、7d、8d和9d的菌丝体制备其原生质体。2.4原生质体制备的一般流程在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.6mol/L渗透压稳定剂甘露醇冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.6mol/L甘露醇渗液冲洗，6500r/min，离心15min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸尽量吸干水分后用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例加入不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、菌株活化培养在超净工作台中，先将储存在试管中的树舌灵芝菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d～6d，直至菌丝长满平皿后备用；S2、优质菌株扩大培养在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打一个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50 mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎，在30℃、摇床转速为155 r/min条件下培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；S3、原生质体的制备在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.7mol/L渗透压稳定剂MgSO4冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.7mol/L MgSO4冲洗，6500r/min，离心15 min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸吸干水分后，用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，然后按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例量取适量的浓度为1%的复合酶液，在容量为50mL的离心管中摇匀之后，32℃酶解3h，使之充分降解，再用四层擦镜纸过滤，获得的滤液转入到5mL离心管中，6500r/min，离心15 min后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。...

【技术特征摘要】
1.木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、菌株活化培养在超净工作台中，先将储存在试管中的树舌灵芝菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d～6d，直至菌丝长满平皿后备用；S2、优质菌株扩大培养在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打一个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎，在30℃、摇床转速为155r/min条件下培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；S3、原生质体的制备在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.7mol/L渗透压稳定剂MgSO4冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.7mol/LMgSO4冲洗，6500r/min，离心15min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸吸干水分后，用精密电子天平准确称量菌丝...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓丹，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22