用于产生化合物的组合物和方法技术

本公开提供了编码转录因子LuxR家族的大ATP结合调控因子(LAL)的核酸、包括此类核酸的载体和宿主细胞以及用于使用此类核酸、载体和/或宿主细胞产生化合物(例如聚酮或β‑内酰胺化合物)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生化合物的组合物和方法背景转录活化因子LuxR家族的大ATP结合调控因子(LAL)为诸如FK506或雷帕霉素(rapamycin)的聚酮的已知转录调控因子。已发现LAL家族在诱导一些类型的天然产物基因簇的表达中具有积极作用，例如PikD对于苦霉素产生以及RapH对于雷帕霉素产生。LAL蛋白含有三个结构域；核苷酸结合域、诱导剂结合域及螺旋-转角-螺旋(DNA结合)结构域。DNA结合域的结构为四螺旋束。该基序中螺旋3的特定蛋白残基序列将LAL引导至原核转录启动子区中所含的特定DNA序列(即，LAL结合位点)。复合物中的LAL或多个LAL结合至产生小分子的基因簇(例如聚酮合酶基因簇或产生β-内酰胺化合物的蛋白质基因簇)内的基因启动子中的特定位点，增强基因簇的表达并且因此促进化合物(例如聚酮或β-内酰胺化合物)的产生。因此，通过优化对产生小分子的对应基因簇(例如PKS基因簇或β-内酰胺化合物基因簇)的调控有机会开发出产生更高效和/或增加的化合物(例如聚酮或β-内酰胺化合物)产生的组合物和方法。专利技术概述本公开提供了编码重组LAL的核酸、包括重组LAL的载体和宿主细胞以及在用于产生化合物(例如聚酮、脂肪酸、类萜、非核糖体多肽、β-内酰胺化合物以及生物碱)的方法中使用这些核酸、载体以及宿主细胞的方法。因此，在第一方面中，本公开提供了一种经过工程化以表达重组LAL(例如异源LAL)的宿主细胞(例如天然缺乏LAL和/或LAL结合位点的宿主细胞)。在一些实施方案中，LAL为组成活性的。在一些实施方案中，通过在核酸中插入LAL结合位点将宿主细胞工程化。在一些实施方案中，重组LAL结合至LAL结合位点促进核酸(例如编码诸如聚酮合酶或产生β-内酰胺化合物的蛋白质等产生化合物的蛋白质的核酸)的转录。在一些实施方案中，LAL结合位点对于LAL为异源的。在一些实施方案中，LAL结合位点对于LAL为内源性的。在一些实施方案中，LAL结合位点包括序列GGGGGT。在一些实施方案中，宿主细胞包括包含异源LAL结合位点的核酸，所述异源LAL结合位点可操作地连接至开放阅读框，使得LAL结合至异源LAL结合位点促进开放阅读框的表达。在一些实施方案中，异源LAL结合位点为合成LAL结合位点。在一些实施方案中，异源LAL结合位点与可操作地连接至开放阅读框的内源性LAL结合位点相比更大程度地促进表达。在一些实施方案中，异源LAL结合位点包括C1-T2-A3-G4-G5-G6-G7-G8-T9-T10-G11-C12(SEQIDNO:2)的至少8个连续核苷酸，其中除了G4、G5、G6、G7、G8、T9以及T10中的任何三个核苷酸(例如G4、G7以及T9；G5、G8以及T10；或G6、G7以及G8)以外没有一个或最多六个核苷酸由任何其他核苷酸置换。在一些实施方案中，重组LAL包括与SEQIDNO:1的序列具有至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)序列同一性的部分。在一些实施方案中，重组LAL包括具有SEQIDNO:1的序列的部分。在一些实施方案中，重组LAL具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。MPAVESYELDARDDELRRLEEAVGQAGNGRGVVVTITGPIACGKTELLDAAAAKSDAITLRAVCSEEERALPYALIGQLIDNPAVASQLPDPVSMALPGEHLSPEAENRLRGDLTRTLLALAAERPVLIGIDDMHHADTASLNCLLHLARRVGPARIAMVLTELRRLTPAHSQFHAELLSLGHHREIALRPLGPKHIAELARAGLGPDVDEDVLTGLYRATGGNLNLGHGLIKDVREAWATGGTGINAGRAYRLAYLGSLYRCGPVPLRVARVAAVLGQSANTTLVRWISGLNADAVGEATEILTEGGLLHDLRFPHPAARSVVLNDLSARERRRLHRSALEVLDDVPVEVVAHHQAGAGFIHGPKAAEIFAKAGQELHVRGELDAASDYLQLAHHASDDAVTRAALRVEAVAIERRRNPLASSRHLDELTVAARAGLLSLEHAALMIRWLALGGRSGEAAEVLAAQRPRAVTDQDRAHLRAAEVSLALVSPGASGVSPGASGPDRRPRPLPPDELANLPKAARLCAIADNAVISALHGRPELASAEAENVLKQADSAADGATALSALTALLYAENTDTAQLWADKLVSETGASNEEEGAGYAGPRAETALRRGDLAAAVEAGSAILDHRRGSLLGITAALPLSSAVAAAIRLGETERAEKWLAEPLPEAIRDSLFGLHLLSARGQYCLATGRHESAYTAFRTCGERMRNWGVDVPGLSLWRVDAAEALLHGRDRDEGRRLIDEQLTHAMGPRSRALTLRVQAAYSPQAQRVDLLEEAADLLLSCNDQYERARVLADLSEAFSALRHHSRARGLLRQARHLAAQCGATPLLRRLGAKPGGPGWLEESGLPQRIKSLTDAERRVASLAAGGQTNRVIADQLFVTASTVEQHLTNVFRKLGVKGRQHLPAELANAE(SEQIDNO:1)。在一些实施方案中，宿主细胞为细菌(例如放线菌，诸如生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)或马来亚链霉菌(Streptomycesmalayensis))。在一些实施方案中，放线菌为S1391、S1496或S2441。在一些实施方案中，已对宿主细胞进行修饰以增强产生化合物的蛋白质(例如聚酮合酶或产生β-内酰胺化合物的蛋白质)的表达。举例来说，在一些实施方案中，已如下对宿主细胞进行修饰以增强产生化合物的蛋白质(例如聚酮合酶或产生β-内酰胺化合物的蛋白质)的表达：(i)缺失表达产生化合物的蛋白质(例如聚酮合酶或产生β-内酰胺化合物的蛋白质)的内源性基因簇；(ii)插入表达产生化合物的蛋白质(例如聚酮合酶或产生β-内酰胺化合物的蛋白质)的异源基因簇；(iii)使所述宿主细胞暴露于抗生素攻击；和/或(iv)引入与同源启动子相比使化合物的表达至少增加两倍的异源启动子。用于增强化合物(例如聚酮或β-内酰胺化合物)的表达的另一方法为优化用于生长的培养基条件。这包括培养基的具体化学和营养物组成、在液体还是固体培养基中进行发酵、发酵的时间过程以及发酵操作的体积/规模。在另一个方面中，本公开提供了一种编码LAL的核酸，其中LAL包括与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)序列同一性的部分。在一些实施方案中，LAL包括具有SEQIDNO:1的序列的部分。在一些实施方案中，LAL具有SEQIDNO:1的序列。在一些实施方案中，核酸在至少一个开放阅读框中缺乏TTA调控密码子。在一些实施方案中，核酸还包含LAL结合位点，例如与SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宿主细胞，其经工程化以表达重组LAL。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.12 US 62/3214391.一种宿主细胞，其经工程化以表达重组LAL。2.如权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞天然缺乏LAL。3.如权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞天然缺乏LAL结合位点。4.如权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞经工程化以在核酸中含有LAL结合位点。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述重组LAL结合至所述LAL结合位点促进所述核酸的表达。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述核酸编码产生化合物的蛋白质。7.如权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述重组LAL包含与SEQIDNO:1(S18LAL)的序列具有至少70％序列同一性的部分。8.如权利要求7所述的宿主细胞，其中所述重组LAL包含具有SEQIDNO:1的序列的部分。9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述重组LAL具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。10.如权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌。11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述细菌为放线菌。12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述放线菌为生二素链霉菌、吸水链霉菌或马来亚链霉菌。13.如权利要求12所述的宿主细胞，其中所述放线菌为S1391、S1496或S2441。14.如权利要求1至13中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞已进行修饰以增强产生化合物的蛋白质的表达。15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞已如下进行修饰以增强产生化合物的蛋白质的表达：(i)缺失表达产生化合物的蛋白质的内源性基因簇；(ii)插入表达产生化合物的蛋白质的异源基因簇；(iii)使所述宿主细胞暴露于抗生素攻击；和/或(iv)引入与同源启动子相比使化合物的表达增加至少2倍的异源启动子。16.如权利要求4至15中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸还包含一个或多个额外的LAL结合位点。17.如权利要求4至16中任一项所述的宿主细胞，其中所述核酸还包含编码LAL的基因。18.如权利要求17所述的宿主细胞，其中编码LAL的所述基因受包含LAL结合位点的启动子的控制。19.如权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞，其中所述LAL结合位点中的至少一个包含在启动子中。20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中所述启动子为双向启动子。21.一种编码LAL的核酸，其中所述LAL包含与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的部分。22.如权利要求21所述的核酸，其中所述LAL包含具有SEQIDNO:1的序列的部分。23.如权利要求22所述的核酸，其中所述LAL具有SEQIDNO:1的序列。24.如权利要求21至23中任一项所述的核酸，其中所述核酸在至少一个开放阅读框中缺乏TTA抑制密码子。25.如权利要求21至24中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含LAL结合位点。26.如权利要求25所述的核酸，其中所述LAL结合位点与SEQIDNO:2(CTAGGGGGTTGC)的序列具有至少80％同一性。27.如权利要求26所述的核酸，其中所述LAL结合位...

【专利技术属性】
技术研发人员：BR鲍曼，JAV布洛杰特，GL维尔丁，DC格雷，JP摩根斯特恩，L富尔斯顿，K罗比森，
申请(专利权)人：华普卓威生物公司，
类型：发明
国别省市：美国,US