基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，具体步骤如下：(1）HAT‑适配体反应：①乙酰化反应，分别取HATp300与多肽，乙酰辅酶A在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合；②向①的反应溶液中加入CoA适配体；③向②的溶液中加入cDNA；(2)电化学发光传感器的制备：a.Au电极；b.prism/Au电极；c.cDNA/prism/Au电极；d.H1‑H2/cDNA/prism/Au电极；e.Ru/H1‑H2/cDNA/prism/Au电极。在乙酰化反应中，改变p300浓度及其小分子抑制剂浓度，探究所制备的一系列传感器对电化学发光信号的影响。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

【技术实现步骤摘要】
基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
本专利技术涉及一种电化学发光传感器及其检测方法，尤其是涉及基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，属于功能生物材料和生物传感

技术介绍
组蛋白乙酰化转移酶(HAT)是一种典型的的生物酶，它通过将乙酰辅酶A上的乙酰基转移至底物组蛋白或者非组蛋白底物多肽的特定赖氨酸残基上，达到调节染色体结构进而调控基因的表达的目的。组蛋白乙酰化功能紊乱或者乙酰转移酶的异常作用与一系列疾病有关，如癌症、代谢综合征和神经失调等。测定HAT活性和它们抑制剂的效力将大大有助于基因转录的生化研究以及抗癌剂的药物发现。通过抗体识别和酶联免疫的方法对HAT进行检测的工作最为典型，如基于多肽连接的量子点以及乙酰基特异性抗体的荧光检测方法和抗体介导的金纳米粒子的比色分析方法等。这些方法虽然具有一定的优势，但是它们还是存在一些内在的缺点，如不同批次之间抗体的差异以及昂贵的抗体标记等。DNA是遗传信息的载体，携带着引导生物发育与生命机能运作的遗传指令，主要功能是储存遗传信息，所以被誉为生命的“蓝图”。随着DNA纳米技术飞速发展，很多研究者可以利用DNA分子自身的识别性质自下而上可控地构建一些精美的DNA纳米结构。Goodman等利用4条单链DNA成功地构建了DNA四面体结构，并尝试用这些合成的DNA四面体研究药物输运控释体系。2010年，樊春海等发现，巯基四面体可组装到金电极的表面，作为电化学的载体，发展了DNA分子传感、免疫传感、核酸适体传感等电化学传感器。研究表明，DNA四面体有良好刚性结构和稳定性，修饰过程中能避免单链的探针间互相缠绕，不需要采用巯基乙醇等小分子来封闭电极，并能较好地“立”在修饰电极表面。他们还发现这种电极有较好的抵抗蛋白质吸附的能力，对于酶放大生物传感器的研制有很大优势。最有意思的是DNA纳米结构能够使电极表面保持类似溶液相性质，这能提高DNA纳米结构悬挂端与目标DNA的结合能力。由于这种DNA纳米结构具有很多特别的性质，如高稳定性、良好抵抗蛋白质吸附能力和核酸强结合能力，尤其这是一种均一的可控纳米界面，能够极大地提高目标分子与传感界面探针间的结合能力。本专利技术构建了一种新型电化学发光生物传感器，检测组蛋白乙酰转移酶(以HATp300为例)活性。该传感器构建过程中，合成了DNA三棱柱结构(prism)，该DNA三棱柱底端有3个巯基，这使得prism能够稳固地吸附在金电极表面，再利用三个悬挂端捕捉“辅酶A(CoA)-适配体-辅助DNA(cDNA)”体系释放出来的cDNA，依次反复打开两条发卡DNA，通过杂交链反应(HCR)形成长的DNA阶梯，通过嵌入电化学发光体，产生电化学发光信号，构建了一种新型的HATp300电化学发光生物传感器。目前国内外未见联合prism、HCR扩增技术和CoA适配体构建HATp300电化学发光传感器的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，具体步骤如下：(1)HAT-适配体反应①乙酰化反应：分别取HATp300(100～1200nM，0.1～1.2μL)与多肽(0.5～1.5mM，0.1～1.2μL)，乙酰辅酶A(0.5～1.5mM，0.5～1.5μL)在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合，总体积1～5μL。将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min；②向①中溶液加入CoA适配体(0.5～3.5μL，0.5～1.5μM)振荡混合均匀，28～38℃水浴反应0.5～3.5h；③向②中加入cDNA(0.5～3.5μL，0.5～1.5μM)振荡混合均匀，总体积5～10μL，28～38℃水浴反应0.5～1.5h，备用。(2)电化学发光传感器的制备a.Au电极金电极(Au)使用前分别用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于0.1MH2SO4溶液中，在-0.3V～+1.2V范围内进行循环伏安扫描5～30min，最后再经超纯水清洗后氮气吹干备用。b.prism/Au电极将2～12μL合成的prism滴涂于处理好的Au表面反应4～12h，通过Au-S键固定DNAprism的自组装单分子层，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。c.cDNA/prism/Au电极将(1)中溶液2～12μL滴涂于prism/Au电极上，28～38℃下静置40～80min，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。d.H1-H2/cDNA/prism/Au电极H1(1～5μL，2～6μM)和H2(1～5μL，2～6μM)混合均匀加热至90～100℃，1～5min，立即在冰上冷却1～5min，滴涂于cDNA/prism/Au电极表面，室温下静置1～3h，随后蒸馏水缓缓冲洗电极。e.Ru/H1-H2/cDNA/prism/Au电极取发光体Ru(2.5～7.5μL，5～15mM)滴涂于H1-H2/cDNA/prism/Au电极，4℃冰箱存放过夜，随后缓缓冲洗电极，之后用于电化学发光检测。步骤(2)中使用的prism(分别将形成prism的三条链标记为L3，Sa和Sb)的合成步骤如下：①将L3(0.1～1.5μM，5～15μL)，Sa(0.1～1.5μM，10～50μL)，10×TAE/Mg2+(2～10μL)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)(10～50mM，1～5μL)混合，加二次蒸馏水至总体积20～100μL，混匀，退火；②将L3(0.1～1.5μM，5～15μL)，Sb(0.1～1.5μM，10～50μL)和10×TAE/Mg2+(2～10μL)混合，加二次蒸馏水至总体积20～100μL，混匀，退火；③按照1∶1的比例混匀①和②溶液，进行退火组装，退火。10×TAE/Mg2+的组成：40mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，20mM醋酸，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及12.5mMMg2+，pH为7.4。prism合成步骤中退火条件为：95℃，5min；65℃，30min；50℃，30min；37℃，30min；22℃，30min；4℃，30min；hold，4℃。在乙酰化反应中，改变p300浓度，探究其对电化学发光信号的影响。所述的电化学参数条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25s；脉冲间隔：30s；初始电压：-1.5V；脉冲电压：-1.5V。专利技术原理：利用上述基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，采用三条DNA链作为原料，经过退火杂交能够形成prism，该结构一个底面含有3个巯基，可以通过Au-S相互作用修饰到金电极表面，另一个底面还有3个悬挂端，可以通过碱基互补配对原则捕获cDNA(部分能与适配体或DNA纳米三棱柱的悬挂端杂交，部分能作为HCR反应的引物链)，达到检测目的。乙酰化反应过程中，随着p300浓度变大，生成的CoA的量增多，可以释放出更多的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，其特征在于，机理如下：采用三条DNA链作为原料，经过退火杂交能够形成DNA三棱柱纳米结构，该结构一个底面含有3个巯基，可以通过Au‑S相互作用修饰到金电极表面，另一个底面还有3个悬挂端，可以通过碱基互补配对原则捕获“CoA‑适配体‑辅助DNA”体系中释放的辅助DNA，引发HCR反应，通过电化学发光实现HATp300的检测。

【技术特征摘要】
1.基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，其特征在于，机理如下：采用三条DNA链作为原料，经过退火杂交能够形成DNA三棱柱纳米结构，该结构一个底面含有3个巯基，可以通过Au-S相互作用修饰到金电极表面，另一个底面还有3个悬挂端，可以通过碱基互补配对原则捕获“CoA-适配体-辅助DNA”体系中释放的辅助DNA，引发HCR反应，通过电化学发光实现HATp300的检测。2.基于DNA纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用，具体步骤如下：(1)HAT-适配体反应①乙酰化反应：分别取HATp300(100～1200nM，0.1～1.2μL)与多肽(0.5～1.5mM，0.1～1.2μL)，乙酰辅酶A(0.5～1.5mM，0.5～1.5μL)在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合，总体积1～5μL。将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min；②向①中溶液加入CoA适配体(0.5～3.5μL，0.5～1.5μM)振荡混合均匀，28～38℃水浴反应0.5～3.5h；③向②中加入cDNA(0.5～3.5μL，0.5～1.5μM)振荡混合均匀，总体积5～10μL，28～38℃水浴反应0.5～1.5h，备用。(2)电化学发光传感器的制备a.Au电极金电极(Au)使用前分别用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末进行打磨，利用超纯水通过超声清洗3次，之后置于氮气流中干燥，再将其浸泡于0.1MH2SO4溶液中，在-...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宇芳，张青青，胡丹丹，马少华，郭智勇，王邃，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33