本发明专利技术公开了一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，结合与奥沙利铂神经毒性(OXIN)相关的瞬时感受器电位(TRP)离子通道的亚型，全细胞膜片钳技术记录OXIN模型大鼠背根神经节(DRG)细胞的基本膜电生理特性。本发明专利技术基于电生理学，提供的一种生物膜片钳分析TRP通道活性的方法，提示抑制TRP通道活性可能是当归四逆汤发挥治疗OXIN效应的重要机制之一。在深入了解当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的作用机制和组方配伍的科学原理上有重要意义，也预示了当归四逆汤在奥沙利铂神经毒性预防上有着广阔应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法。
技术介绍
奥沙利铂(OxaliplatinOXA)是继顺铂和卡铂后的第3代铂族金属抗肿瘤药物。其抗癌谱更广，且与顺铂和卡铂无交叉耐药，是目前胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药之一。奥沙利铂最常见的不良反应为外周神经毒性(Oxaliplatin-inducedneurotoxicityOXIN)，接受奥沙利铂治疗5-7个月的患者中约50％发生中-重度周围神经病变，且呈剂量依赖和累积性，限制了该药的剂量和临床疗效的进一步发挥。奥沙利铂神经毒性发生机制目前尚不完全明确。已报道的机制包括：①与离子通道尤其是电压门控的Na+通道有关；②与DNA损伤，包括对特定的在细胞凋亡和细胞周期间起平衡调节的分子作用有关；③与血清神经生长因子(nervegrowthfactorNGF)水平的下降有关；④近期的研究与瞬时感受器电位(transientreceptorpotentialTRP)通道有关。TRP超家族离子通道在多种感觉传导，特别是听觉、触觉、机械性痛等感觉过程中起着重要的作用。TRP超家族蛋白作为非选择性阳离子通道对Ca2+具有高通透性，是感受体系中的门控分子，也是外部环境与神经系统之间的中介，可以将热刺激、化学刺激以及机械刺激转换为内向电流，是产生温度和疼痛感觉的第一步。TRP家族主要由七个亚族组成：TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN等。继1997年Caterina等在背根神经节成功克隆了TRPV1受体后，TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8和TRPA1也相继被发现存在于DRG中。这些离子通道被认为参与了化学物质、温度以及机械刺激所诱导的痛觉的形成。目前研究显示TRPV1、TRPA1、TRPM8可能参与到奥沙利铂神经毒性中。体内试验显示TRPV1在化疗诱导的奥沙利铂神经毒性中起到重要作用，和外周神经损伤后诱导的神经痛相似。Lauren等也报道应用奥沙利铂后TRPV1、TRPA1、TRPM8mRNA表达增加，并指出TRPV1可能起到主要的作用。Histopathology实验中TRPA1缺陷小鼠未反应出机械痛和冷过敏，而使用奥沙利铂后细胞内cAMP增加，诱导TRP通道开放，导致神经元损伤。有几项研究显示DRGTRPM8mRNA在奥沙利铂诱导的亚急性外周神经毒性中表达一过性的上调。TakehiroKawashiri等也通过实验证实奥沙利铂可以诱导大鼠DRGTRPM8mRNA、TRPM8蛋白表达上调和钙离子内流，并发现钙离子通道阻滞剂能够改变这种变化。虽然临床用于防治奥沙利铂神经毒性的药物较多，但都没有获得明确的推荐，理想的药物是在改善奥沙利铂外周神经毒性的同时，既不削减奥沙利铂的抗肿瘤活性，又不促进肿瘤生长，并且本身不具有内在毒性。总体而言，西医在防治奥沙利铂神经毒性方面没有更为理想的方法，所以中医药的运用显示越来越重要的作用。目前已有报道，当归四逆汤在防治奥沙利铂神经毒性上取得了较好的临床效果，由奥沙利铂神经毒性引起的手足麻木疼痛等表现得到了不同程度的缓解，同时发现当归四逆汤可明显延缓奥沙利铂神经毒性动物模型的疼痛阈值下降的时间和幅度，并且其主要作用靶点在背根神经节(DRG)，通过下调大鼠L4-6脊髓中NR2B的表达，以及上调L5DRG中pNF-H蛋白水平来介导。通过电生理学方法分析当归四逆汤对于TRP通道活性的作用还未见报道。在深入了解当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的作用机制和组方配伍的科学原理上有重要意义，也预示了当归四逆汤在奥沙利铂神经毒性预防上有着广阔应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释当归四逆汤发挥预防奥沙利铂神经毒性的作用机制的难点，提供一种基于电生理学的分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，为奥沙利铂神经毒性的预防治疗提供依据。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：构建奥沙利铂神经毒性大鼠模型，急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞，利用全细胞膜片钳技术，记录分离的各组DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性，分析奥沙利铂神经毒性与TRP通道活性的关系。对当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性的机制及研究方法有了进一步认识。为了达到上述目的，本专利技术的具体步骤如下：1、所述构建奥沙利铂神经毒性大鼠模型按如下步骤进行：1)将大鼠随机分为5组，每组6只，分别为空白组、模型组、当归四逆汤低、中、高剂量组；2)除空白组予以腹腔注射5％葡萄糖注射液4mg/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂(按奥沙利铂注射液计1.6ml/kg)，一周两次，共四周(时间点分别为d1，d2，d8，d9，d15，d16，d22，d23)；3)当归四逆汤药方为当归12g、桂枝9g、细辛3g、白芍9g、通草6g、甘草6g、大枣9g。当归四逆汤成人处方生药量为54g(生药低剂量含量0.62g/ml，中剂量1.24g/ml，高剂量2.48g/ml)，当归四逆汤各组灌胃给药10ml/kg，每日1次，空白组、模型组予0.9％NaCl溶液灌胃10ml/kg，每日1次，奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前一小时给药；4)平时观察大鼠一般情况，每7天测一次体重，并通过VonFrey纤维细丝测量大鼠的诱发痛觉，检测机械疼痛阈值。2、所述急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞按如下步骤进行：麻醉处死大鼠，快速分离并切取L4-L5位的神经节，无菌条件下仔细剥离脊膜及血管；胰蛋白酶消化组织块，37℃，10min，制成细胞悬液；离心细胞悬液(1000rpm，10min，4℃)，弃去上清液，加入DMEM-F12培养基重悬，200目细胞筛过滤；将滤液进行台盼蓝拒染试验，血细胞计数板镜下计数；将细胞接种到培养板，置37℃、5％CO2培养箱培养过夜；体外培养，更换为Ara-C工作液，作用24h后吸出；此后更换为神经元维持培养基培养细胞用于实验。3、所诉利用全细胞膜片钳技术，记录分离的各组DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性按如下步骤进行：1)标本制备：将生长状态良好的DRG细胞，分为20组，如下组1.空白组DRG组2.模型组DRG组3.当归四逆汤低剂量组DRG组4.当归四逆汤中剂量组DRG组5.当归四逆汤高剂量组DRG组6.空白组DRG+TRPV1激动剂辣椒素组7.模型组DRG+TRPV1激动剂辣椒素组8.当归四逆汤低剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素组9.当归四逆汤中剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素组10.当归四逆汤高剂量组DRG+TRPV1激动剂辣椒素组11.空白组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇组12.模型组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇组13.当归四逆汤低剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇组14.当归四逆汤中剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇组15.当归四逆汤高剂量组DRG+TRPM8激动剂薄荷醇组16.空白组DRG+TRPA1激动剂芥子油组17.模型组D本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.本专利技术公开了一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，其特征在于，结合与奥沙利铂神经毒性(OXIN)相关的瞬时感受器电位(TRP)离子通道的亚型，全细胞膜片钳技术记录慢性OXIN模型大鼠背根神经节(DRG)细胞的基本膜电生理特性，研究当归四逆汤防治奥沙利铂神经毒性的作用机理。
【技术特征摘要】
1.本发明公开了一种基于电生理学分析当归四逆汤预防奥沙利铂神经毒性机制的研究方法，其特征在于，结合与奥沙利铂神经毒性(OXIN)相关的瞬时感受器电位(TRP)离子通道的亚型，全细胞膜片钳技术记录慢性OXIN模型大鼠背根神经节(DRG)细胞的基本膜电生理特性，研究当归四逆汤防治奥沙利铂神经毒性的作用机理。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)构建奥沙利铂神经毒性大鼠(OXIN)模型及背根神经节(DRG)细胞急性分离；b)全细胞膜片钳技术记录DRG细胞及加入TRPV1激动剂辣椒素、TRPM8激动剂薄荷醇、TRPA1激动剂芥子油后基本膜电生理特性；c)分析奥沙利铂神经毒性与TRP通道活性的关系。3.根据权利要求2所诉的方法，其特征在于：步骤a)具体如下：1)奥沙利铂神经毒性大鼠造模：Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、当归四逆汤低剂量组、当归四逆汤中剂量组、当归四逆汤高剂量组。除空白组予以腹腔注射5％葡萄糖注射液4mg/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利铂。一周两次，共四周。2)给药：当归四逆汤药方为当归12g、桂枝9g、细辛3g、白芍9g、通草6g、甘草6g、大枣9g，共计54g。当归四逆汤成人处方生药量为54g(生药低剂量含量0.62g/ml，中剂量1.24g/ml，高剂量2.48g/ml)，当归四逆汤各组灌胃给药10ml/kg，每日1次，空白组、模型组予0.9％NaCl溶液灌胃10ml/kg，每日1次。奥沙利铂用药当天，中药于奥沙利铂应用前一小时给药。3)体重测量与痛阈测试结果：平时观察大鼠一般情况，每7天测一次体重，并通过VonFrey纤维细丝测量大鼠的诱发痛觉，检测机械疼痛阈值。4)急性分离奥沙利铂神经毒性大鼠DRG细胞：麻醉处死大鼠，快速分离并切取L4-L5位的神经节，分离及培养大鼠脊髓神经元细胞。4.根据权利要求2所诉的方法，其特征在于：步骤b)具体如下：1)标本制备：将生长状态良好的DRG细胞，分为20组，如下：组1.空白组DRG组2.模型组DRG组3.当归四逆汤低剂量组DRG组4.当归四逆汤中剂量组DRG组5.当归四逆汤高剂量组DRG组6.空白组DRG+TRPV1...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏国利，顾展丞，安振涛，
申请(专利权)人：丁蓉，霍介格，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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