一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法技术方案

本发明专利技术公开了一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法，属于反向遗传学应用领域。所述系统，包括以下组成：包含腮腺炎病毒全基因组cDNA的重组转录载体；包含腮腺炎病毒NP基因的辅助质粒Ⅰ；包含腮腺炎病毒P基因的辅助质粒Ⅱ；以及包含腮腺炎病毒L基因的辅助质粒Ⅲ。本发明专利技术利用3+1质粒拯救系统(表达MuV‑S79株N蛋白、P蛋白、L蛋白的辅助质粒和重组转录载体)能够有效地从体外拯救出腮腺炎病毒，重组腮腺炎病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造，克服了传统疫苗生产费时费力、工艺复杂等问题。另外，为以后运用分子克隆技术改造腮腺炎病毒开发新型疫苗提供了解决方案。

【技术实现步骤摘要】
一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法
本专利技术涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法。
技术介绍
腮腺炎是一种急性呼吸道传染病，主要通过呼吸道飞沫传播，多见于5-15岁患者。由于腮腺炎病毒对腺体组织和神经组织具有高度亲和性，可使多种腺体(腮腺、舌下腺、胰腺、生殖腺等)发生炎症改变，一旦侵犯神经系统，可导致脑膜炎等严重病变。腮腺炎病毒(mumpsvirus)是腮腺炎的病原体，属于副粘液病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒。腮腺炎病毒基因组结构为：N-P-M-F-SH-HN-L，分别编码以下蛋白：核壳蛋白(N)，磷酸化蛋白(P)，膜蛋白(M)，融合蛋白(F)，小疏水蛋白(SH)，血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)及大蛋白(L)。接种疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措施，对于家庭来说也是减少成员疾病发生、减少医疗费用的有效手段。我国于1979年从美国引入Jeryl-Lynn毒株，在原代鸡胚细胞减毒传3代后生产S79毒株。1990年开始生产S79株的腮腺炎疫苗，至今已经超过1亿剂腮腺炎疫苗用于中国儿童预防腮腺炎，该毒株具有病毒滴度较高，免疫原性较好，而临床反应轻的特点，各地使用后的抗体阳转率达82.6％-88.6％。但是最初制备腮腺炎疫苗的工艺较为复杂，需要在不同的细胞系中传代许多次才能得到减毒的毒株，费时费力，不利于大规模生产。疫苗的开发是一个漫长而复杂的过程，且成本很高。全病毒灭活疫苗、裂解腮腺炎疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的腮腺炎减毒疫苗又存在着毒力恢复等缺陷。反向遗传学的发展使得对负链RNA病毒进行遗传操作成为可能，1994年SchnellMJ等成功地从质粒DNA获取了重组体狂犬病病毒，这是反向遗传学技术在负链RNA病毒的首次应用(SchellMJ，MebatsionT，ConzelmannKK.InfectiousrabiesvirusfromclonecDNA.EMBOJ.1994，13：4195-4203)。利用反向遗传学系统拯救出的病毒使对病毒的分子特征、致病机理、病毒与宿主之间的相互作用以及活载体疫苗的构建和制备的研究更为方便、快捷、深入。不仅如此，通过此技术构建的RNA病毒载体还可用于基因治疗，新型致弱活病毒嵌合疫苗的研制也得益于此。尽管一些负链RNA病毒的反向遗传学的系统已经成功拯救出来(ClarkeDK,SidhuMS,JohnsonJE,UdemSA.RescueofmumpsvirusfromcDNA.JVirol.2000；74(10):4831-4838)，但其所使用的载体质粒在拯救负链RNA病毒方面存在一些不足，并且体系和方法较为复杂，拯救难度较大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，利用反向遗传学技术将腮腺炎病毒疫苗株全基因组整合到载体中构建出重组质粒，并通过拯救系统拯救出病毒，从而弥补了用传统方法制备腮腺炎病毒疫苗过程中遇到的不足。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，包括以下组成：包含腮腺炎病毒全基因组cDNA的重组转录载体；包含腮腺炎病毒NP基因的辅助质粒Ⅰ；包含腮腺炎病毒P基因的辅助质粒Ⅱ；以及包含腮腺炎病毒L基因的辅助质粒Ⅲ。所述重组转录载体为采用同源重组方法，高效地将腮腺炎病毒全基因组cDNA连入载体中制得。作为优选，所述腮腺炎病毒为腮腺炎S79减毒疫苗株，基因登录号为MH426702.1，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。S79疫苗株全长基因组的有8个DNA片段，8个片段分别是NP、P、M、F、SH、HN、L1和L2。作为优选，所述的重组转录载体中腮腺炎病毒全基因组cDNA的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列，病毒的基因组的长度对病毒的复制和转录非常重要，具有自我剪切功能的核酶能保证转录产物的正确性，有利于病毒的拯救。作为优选，所述腮腺炎病毒全基因组cDNA的3’端包含丁肝病毒核酶序列。作为优选，所述的重组转录载体为包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的腮腺炎病毒全基因组cDNA的pYES-MuV质粒。所述pYES-MuV质粒的构建方法，包括：(1)以S79疫苗株全长基因组cDNA为模板，利用5对相互有重叠的引物分别进行PCR扩增获得涵盖S79疫苗株全长基因组的基因片段MuV-NP-P、MuV-M-F、MuV-SH-HN、MuV-L1、MuV-L2；(2)通过体外定点突变方式对MuV-SH-HNDNA片段进行沉默突变引入基因标记，获得目的片段为MuV-SH-HN-M1；所用引物为MuV-8134-F：5’-tgcactgctaaactcaagcacaaccagg-3’，MuV-8134-R：5’-cctggttgtgcttgagtttagcagtgca-3’；(3)人工合成含有T7RNA聚合酶启动序列，丁型肝炎病毒核酶序列和T7RNA终止子序列的双链DNA片段，通过双酶切的方式连接到pYES-2载体中，构建中间质粒pYES-TRZ；(4)将MuV-NP-P、MuV-M-F、MuV-SH-HN-M1、MuV-L1、MuV-L2一次性连到线性化的pYES-TRZ载体中获得阳性质粒pYES-MuV-S79。病毒的N、P、L蛋白是病毒复制所必需，作为优选，所述的辅助质粒Ⅰ为包含核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基因片段MuV-NP-CDS的pT7-MuV-NP质粒。所述的辅助质粒Ⅱ为包含核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的基因片段MuV-P-CDS的pT7-MuV-P质粒。所述的辅助质粒Ⅲ为包含核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的基因片段MuV-L-CDS的pT7-MuV-L质粒。本专利技术还提供了一种拯救腮腺炎病毒的方法，包括以下步骤：(1)将所述的用于拯救腮腺炎病毒系统中的重组转录载体和辅助质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共转染入辅助细胞中；(2)培养后收集细胞与上清混合物感染Vero细胞，传代，纯化拯救获得腮腺炎病毒疫苗株。作为优选，步骤(1)中，重组转录载体、辅助质粒Ⅰ、辅助质粒Ⅱ和辅助质粒Ⅲ的混合比例为5：1.5：1.5：0.5，经多次试验摸索该重组比例病毒能够保证高的拯救效率，以此比例拯救腮腺炎病毒的成功率为100％。作为优选，所述辅助细胞为密度为60％-70％的BHK-T7-SR-19细胞。本专利技术具备的优势：本专利技术提供的3+1质粒拯救系统(表达MuV-S79株N蛋白、P蛋白、L蛋白的辅助质粒和重组转录载体)能够有效地从体外拯救出腮腺炎病毒，重组腮腺炎病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造，克服了传统疫苗生产费时费力、工艺复杂等问题。另外，为以后运用插入、缺失、突变、移码等分子克隆技术改造腮腺炎病毒提供了基础，为候选腮腺炎疫苗的快速成型提供了解决方案，缩短了疫苗开发的时间与成本。附图说明图1为本专利技术实施例中腮腺炎病毒分段扩增示意图。图2为本专利技术实施例中MuV-NP-P、MuV-M-F、MuV-SH-HN-M1、MuV-L1和MuV-L2核苷酸序列片段PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳验证结果图。图3为本专利技术实施例中辅助质粒pT7-MuV-NP、pT7-MuV-P和pT7-MuV-L构建过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，包括以下组成：包含腮腺炎病毒全基因组cDNA的重组转录载体；包含腮腺炎病毒NP基因的辅助质粒Ⅰ；包含腮腺炎病毒P基因的辅助质粒Ⅱ；以及包含腮腺炎病毒L基因的辅助质粒Ⅲ。

【技术特征摘要】
1.一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，包括以下组成：包含腮腺炎病毒全基因组cDNA的重组转录载体；包含腮腺炎病毒NP基因的辅助质粒Ⅰ；包含腮腺炎病毒P基因的辅助质粒Ⅱ；以及包含腮腺炎病毒L基因的辅助质粒Ⅲ。2.如权利要求1所述的用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，所述腮腺炎病毒为腮腺炎S79减毒疫苗株。3.如权利要求1所述的用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，所述的重组转录载体中腮腺炎病毒全基因组cDNA的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列。4.如权利要求3所述的用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，所述腮腺炎病毒全基因组cDNA的3’端包含丁肝病毒核酶序列。5.如权利要求1所述的用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，所述的重组转录载体为包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的腮腺炎病毒全基因组cDNA的pYES-MuV质粒。6.如权利要求1所述的用于拯救腮腺炎病毒的系统，其特征在于，所述的辅助质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵正言，汪一龙，黄耀伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33