一种提取漆树漆酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种提取漆树漆酶的方法，属于生物酶领域。先将天然生漆液用丙酮制得丙酮粉末，粉末用浸提液溶解后抽滤，滤液采用葡聚糖凝胶G‑100与CM‑葡聚糖凝胶C‑25或CM‑葡聚糖凝胶C‑50进行柱层析分离后脱盐，最后冷冻干燥得漆树漆酶纯品。本发明专利技术分离技术操作方便快捷，得率较高，所得漆酶纯度好，活性高，可广泛应用于有机污染物处理、纸浆漂白、生物传感器、纺织物染整、食品改良等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种提取漆树漆酶的方法
本专利技术涉及一种提取具有高纯度、高浓度及高活性的漆树漆酶的方法，属于生物酶领域。
技术介绍
漆树漆酶是来自漆树的一种天然的酶，它是生漆催化漆酚聚合的催化剂。漆酶作为一种四铜糖蛋白的氧化还原酶，它通过氧气氧化底物，并且能够催化氧化多种底物。但是由于漆树漆酶的活力偏低且制备成本较高，极大地限制了漆树漆酶在各个领域的应用实施。文献中提取漆树漆酶采用硫酸铵沉淀—阳离子交换层析—阴离子交换层析—冷冻干燥等方法，此提取方法易失去漆酶中的铜原子，影响其结构和活性且提取成本较高，分离时间长，难以大批量生产。专利CN102559621A报道了采用超滤机和喷雾干燥机来制备真菌漆酶的方法，但此方法中的高温会严重影响漆树漆酶的活性。Reinhammar报道的方法中虽然可以避免硫酸铵沉淀来获得漆酶，但是由于溶液中含有大量的多糖和其他小分子杂质，在过CM-sephadexC50柱时会有如下问题：(1))凝胶塌陷，使分离效果变差，柱子也不利于重复使用；(2)一些杂质会挂在柱上堵塞凝胶，使流速越来越慢；这些杂质在柱中呈白色颗粒状，很难除去而影响凝胶的再次使用；此方法凝胶损耗太大，因而会大大提升分离纯化成本；(3)多糖结合的一些阳离子会将漆酶交换下来，这也不利于分离纯化；(4)采用阳离子交换柱与阴离子交换柱相结合的方式来提取漆酶，该方法会对阳离子树脂造成很大的伤害，以至于造成树脂只能使用一次，不能再生重复使用，并且此方法成本较高、提取时间较长。
技术实现思路
针对上述漆树漆酶制备方法中的不足，本专利技术先利用交联葡聚糖凝胶G-100的分子筛作用进行分级，再采用CM-葡聚糖凝胶C-25(CMSephadexC-25)或CM-葡聚糖凝胶C-50(CMSephadexC-50)进行阳离子交换层析，从而制备出高纯度和高活性的漆酶。实现本专利技术目的的技术手段如下：本专利技术的提取漆树漆酶的方法，是将天然生漆液用丙酮制得丙酮粉末，粉末用浸提液溶解后抽滤，滤液采用凝胶柱层析和阳离子柱层析进行分离后透析脱盐，最后冷冻干燥得漆树漆酶纯品。所述的浸提液为磷酸盐缓冲溶液，pH值为5.5-6.5。该浸提液在整个提取过程中不影响漆酶的活性。所述的柱层析指凝胶柱层析和阳离子柱层析，凝胶柱层析所用凝胶为葡聚糖凝胶G-100，阳离子柱层析所用填料为CM-葡聚糖凝胶C-25或CM-葡聚糖凝胶C-50。选用葡聚糖凝胶G-100可以优先分去大部分多糖组分和几乎全部的有机小分子级分，使收集到的含漆酶级分中仅剩小部分多糖，大大减小了后续分离的压力；从葡聚糖凝胶G-100层析柱流出的溶液再进入CM-葡聚糖凝胶C-25或CM-葡聚糖凝胶C-50层析柱，漆酶被支载在柱上而多糖则流出，从而实现二者的完全分离；此后只要用较浓的磷酸盐缓冲溶液洗脱漆酶，就可得到仅含漆酶的磷酸盐缓冲溶液了。进一步地，漆酶的磷酸盐缓冲溶液采用葡聚糖凝胶G-25层析柱层析脱盐，或者采用透析袋对去离子水透析脱盐，或者采用超滤膜超滤脱盐，最后经冷冻干燥可以得到高纯的漆酶粉末。所得产品铜的质量百分含量为2.28‰～2.32‰，280nm与614nm处吸光度比值(A280nm/A614nm)为18.45～20.43。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术采用SephadexG-100和CMSephadexC-50(或C-25)组合的柱层析分离，较其它搭配相比，SephadexG-100可以优先分离掉大部分的糖组分和几乎全部的有机小分子级分，剩余小部分的多糖和漆酶组分在过C-50时，不仅分离时间缩短，分离效率显著提高，并且大大减小了对CMSephadexC-50的损害，可重复使用，降低了实验成本。(2)本专利技术提取过程简单，方便快捷，成本低，得率高(高达0.3％-0.4％)，并且采用本专利技术方法提取的漆酶纯度高，活性高，可广泛应用于有机污染物处理、纸浆漂白、生物传感器、纺织物染整、食品改良等领域。附图说明图1为本专利技术实施例4制得的漆树漆酶的GPC谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。实施例1取1kg生漆液加入5倍量丙酮浸泡并充分搅拌，静置过夜，离心、用丙酮洗涤沉淀物直至沉淀接近灰白色，阴干沉淀后得丙酮粉末。将丙酮粉末加入2.0L0.01ml/L的磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)中搅拌4h后过滤得到墨绿色的漆酶提取液。漆酶提取液加载到SephadexG-100凝胶柱，以0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)洗脱，收集蓝色层析带漆酶溶液。将经SephadexG-100分离的蓝色漆酶溶液加载到CMSephadexC-50阳离子交换柱，然后用1.0L的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)洗柱，随后再用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH5.8)洗脱柱上的蓝带，即得漆酶溶液。将该漆酶溶液装入透析袋(切割分子量10000Da)中，对0.01mol/LpH＝5.8的磷酸盐缓冲溶液透析24h，继续对蒸馏水透析48h，最后冷冻干燥即得固体漆酶纯品，得率0.31％。该纯漆酶中铜的质量百分含量为2.31‰，280nm与614nm处吸光度比值(A280nm/A614nm)为20.12。所有步骤都是在温度4-5℃左右的环境温度下进行的。实施例2将上述丙酮粉末加2.0L0.01mol/LpH＝5.5的磷酸盐缓冲溶液，搅拌过夜后离心并抽滤。滤液加载到SephadexG-100凝胶柱，以0.01mol/LpH＝5.5的磷酸盐缓冲溶液洗脱，恒流泵流速控制在20-26ml/h，收集蓝色层析带漆酶溶液。酶溶液加载到CMSephadexC-50阳离子交换柱上，用1.0L0.01mol/LpH＝5.5的磷酸盐缓冲溶液洗脱，然后将缓冲液的浓度提高至0.15mol/L继续洗脱，收集蓝色流出液，该流出液采用葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐后冷冻干燥得漆酶纯品，得率0.35％。该纯漆酶中铜的质量百分含量为2.28‰，280nm与614nm处吸光度比值(A280nm/A614nm)为18.58。所有步骤都是在温度4-5℃左右的环境温度下进行的。实施例3将上述丙酮粉末加2.0L0.01mol/LpH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液，搅拌过夜后离心并抽滤。滤液加载到SephadexG-100凝胶柱，以0.01mol/LpH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱，恒流泵流速控制在20-26ml/h，收集蓝色层析带漆酶溶液。酶溶液加载到CMSephadexC-25阳离子交换柱上，恒流泵流速控制在300-350ml/h，用1.0L0.01mol/LpH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱，然后将缓冲液的浓度提高至0.10mol/L继续洗脱，收集蓝色流出液，将该漆酶溶液装入透析袋(切割分子量10000Da)中，对0.01mol/LpH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液透析24h，继续对蒸馏水透析48h，最后冷冻干燥即得固体漆酶纯品，得率0.30％。该纯漆酶中铜的质量百分含量为2.31‰，280nm与614nm处吸光度比值(A280nm/A614nm)为18.99。所有步骤都是在温度4-5℃左右的环境温度下进行的。实施例4将上述丙酮粉末加入到2.0L0.01mol/LpH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液，搅拌过夜后离心并抽滤。滤液加载到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取漆树漆酶的方法，其特征在于：将天然生漆用丙酮沉淀得到粉末，粉末用浸提液溶解后过滤，得提取液后经柱层析分离，洗脱，收集洗脱液后脱盐，最后冷冻干燥得漆酶纯品。

【技术特征摘要】
1.一种提取漆树漆酶的方法，其特征在于：将天然生漆用丙酮沉淀得到粉末，粉末用浸提液溶解后过滤，得提取液后经柱层析分离，洗脱，收集洗脱液后脱盐，最后冷冻干燥得漆酶纯品。2.如权利要求1所述提取漆树漆酶的方法，其特征在于：所述的浸提液为磷酸盐缓冲溶液，pH值为5.5-6.5。3.如权利要求1所述提取漆树漆酶的方法，其特征在于：所述的柱层析为凝胶柱层析和阳离子柱层析，提取液先加载到凝胶柱层析，后经过阳离子柱层析分离。4.如权利要求3所述提取漆树漆酶的方法，其特征在于：所述凝...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建红，陈楠，高梁河，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32