使用高通量荧光流式细胞仪进行细胞分选制造技术

在一个方面，公开了一种在流式细胞术系统中分选细胞的方法，所述方法包括用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射细胞以从所述细胞引出荧光辐射，检测所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且在并未基于所述荧光数据生成所述细胞的图像(即，逐像素图像)的情况下处理所述时间荧光数据以得出关于所述细胞的分选决定。换句话说，虽然荧光数据可以含有将允许生成逐像素荧光强度图的图像数据，但是所述方法在不生成这种图的情况下得出分选决定。在一些情况下，可以用小于约100微秒的延迟时间作出分选决定。在一些实施方案中，上述分选细胞的方法可以具有亚细胞分辨率，例如，分选决定可以是基于细胞组分的特征。在采用超过两个频移光学频率的一些实施方案中，采用单个射频偏移来分离光学频率，而在其他此类实施方案中采用多个不同的射频偏移。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用高通量荧光流式细胞仪进行细胞分选相关申请本申请要求于2016年3月17日提交的标题为“CellSortingUsingAHighThroughputFluorescenceFlowCytometer”的临时申请号62/309,806的优先权，并且将该临时申请通过引用以其全文并入本文。政府权利本专利技术由美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)(批准号NSF1447381)资助。政府对本专利技术享有某些权利。
技术介绍
本专利技术总体上涉及用于例如经由样品的荧光分析确定流过流式细胞仪的颗粒的特征的设备和方法，并且更具体地涉及用于在流式细胞仪中基于例如它们的特征分选颗粒(例如分选细胞)的设备和方法。从异质群体中分离亚群体或甚至单个细胞在现代生物学和生物医学中具有多种应用。用于分离细胞亚群的一些常规技术包括荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)、激光捕获显微切割和DEP阵列分选。虽然在细胞分选应用中常规使用，但这些技术存在许多缺点。例如，广泛用于细胞生物学的所有领域的FACS缺乏亚细胞分辨率，并因此仅基于细胞参数的平均值作出分选决定。此外，基于成像细胞的常规分选方法由于它们在作出分选决定中的高延迟时间通常不能用于高通量细胞分离应用。因此，对用于例如在流式细胞术系统中分选细胞的改进方法和系统存在需求。
技术实现思路
在一个方面，公开了一种确定颗粒特征的方法，该方法包括在颗粒流过流式细胞术系统时用射频调制的光束照射该颗粒以便从该颗粒引出至少一个辐射响应，检测从该颗粒发出的辐射响应以生成与该辐射响应相关的时间波形数据，并且处理该波形数据以获得该颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，在并未基于波形数据生成颗粒的图像的情况下执行该处理步骤。在一些实施方案中，辐射响应可以是荧光辐射或散射辐射中的任何一种。在一些实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得颗粒的至少一个特征的估计相关的延迟时间等于或小于约100微秒，例如等于或小于约20微秒。在一些实施方案中，射频调制的光束包括彼此分离至少一个射频的至少两个光学频率。在此类实施方案中，该处理步骤可以包括分析与在所述辐射响应中检测到的至少一个射频相关的至少一个拍频，以确定颗粒的至少一个特征的估计。上述方法可以用于确定颗粒的各种不同特征的估计。通过举例的方式，颗粒的特征可以是以下中的至少一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、辐射响应的点状度、从颗粒发出的荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶(Fourier)分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。在相关方面，颗粒的至少一个特征的估计可以用于得出关于该颗粒的分选决定。在相关方面，公开了一种确定颗粒的一个或多个特征的方法，该方法包括在颗粒流过流式细胞术系统时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射该颗粒以从该颗粒引出荧光辐射，检测来自该颗粒的荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理该时间荧光数据以获得该颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，在并未基于时间荧光数据生成荧光图像的情况下执行该处理步骤。在一些实施方案中，该处理步骤可以包括分析一个或多个调制时间荧光数据的拍频以获得该颗粒的至少一个特征的所述估计。在一些实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得该颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒，例如小于约20微秒。在一些实施方案中，所确定的特征可能与颗粒的内部组分相关。在一些实施方案中，所确定的特征可以是以下中的任何一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、荧光辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、颗粒位于照射辐射焦点的程度的量度。在一些实施方案中，照射颗粒的步骤包括将颗粒暴露于光学辐射束，该光学辐射束包括至少两个小束，每个小束具有所述至少两个光学频率之一，这样使得所述小束照射颗粒内的至少两个空间位置。在一些实施方案中，两个照射的空间位置部分重叠。在一些实施方案中，可以用至少两种荧光标记对颗粒染色，其中每种标记被配置成响应于通过具有一个光学频率的辐射的照射而发射荧光辐射。在此类实施方案中，该方法可以进一步包括收集和数字化从这些标记发出的荧光信号，以生成每个对应于一个标记的时间荧光波形。可以处理这些荧光波形以获得荧光信号的共定位的量度。通过举例的方式，荧光波形的处理可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成至少一个乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，并将积分值与预定阈值进行比较以获得共定位的量度。在一些实施方案中，共定位量度的确定可以包括将高通或带通滤波器应用于至少一个波形以生成至少一个滤波波形、随后进行波形的逐点乘法以生成合成乘法波形，对乘法波形进行积分以获得积分值，从积分值中减去背景值，并按强度换算合成值以生成最终值，并将最终值与预定阈值进行比较以获得共定位量度。在上述方法的一些实施方案中，处理的步骤包括获得沿着与流式细胞术系统中的颗粒流动的方向基本上垂直的方向的颗粒侧向尺寸的估计。在上述方法的一些实施方案中，采用荧光波形通过将波形平方、将带通滤波器应用于平方的波形、对滤波波形进行积分、并将积分值与预定阈值进行比较来获得颗粒侧向尺寸的估计。在一些实施方案中，可以基于响应于照射步骤从颗粒发出的荧光辐射的脉冲的时距来获得在与流式细胞仪中的颗粒流动方向平行的方向上的颗粒尺寸的估计。在一些实施方案中，可以使用在与颗粒流动方向垂直的方向和平行的方向上的颗粒尺寸的估计来获得颗粒纵横比的估计。上述方法可以应用于各种不同的颗粒。通过举例的方式，颗粒可以是以下中的任何一种：细胞、小生物体(例如，线虫秀丽隐杆线虫(c.elegan))、珠粒、微粒、纳米颗粒、病毒颗粒、细菌、外来体或药物制品。在一些实施方案中，颗粒可以是哺乳动物细胞，例如患病细胞。在相关方面，颗粒的至少一个特征的估计可以用于得出关于该颗粒的分选决定，如下面更详细讨论的。在相关方面，公开了一种确定颗粒的特征的方法，该方法包括用射频调制的光束照射颗粒以便从该颗粒中引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，检测从该颗粒发出的荧光辐射或散射辐射以生成时间荧光或散射波形数据，并且处理任何荧光和散射数据以获得颗粒的至少一个特征的估计。在一些实施方案中，可以在并未基于时间荧光或散射波形数据生成颗粒的图像的情况下形成该处理步骤。在一些此类实施方案中，该处理步骤足够快使得与获得该颗粒的至少一个特征的估计相关的延迟时间小于约100微秒，例如小于约20微秒。在上述方法的一些实施方案中，颗粒的特征可以包括以下中的至少一个：颗粒的维度尺寸、颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、荧光辐射的点状度、荧光辐射的空间分布的量度、颗粒的位置或取向的量度、颗粒的偏心率的量度、颗粒与参考颗粒相似性的量度、颗粒的一个或多个空本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定颗粒的一个或多个特征的方法，所述方法包括：当颗粒流过流式细胞术系统时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射所述颗粒以从所述颗粒引出荧光辐射，检测来自所述颗粒的所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理所述时间荧光数据以获得所述颗粒的至少一个特征的估计。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.17 US 62/309,8061.一种确定颗粒的一个或多个特征的方法，所述方法包括：当颗粒流过流式细胞术系统时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射所述颗粒以从所述颗粒引出荧光辐射，检测来自所述颗粒的所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理所述时间荧光数据以获得所述颗粒的至少一个特征的估计。2.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括分析调制所述时间荧光数据的一个或多个拍频以获得所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。3.如权利要求1所述的方法，其中在未基于所述时间荧光数据生成荧光图像的情况下执行所述处理步骤。4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征与所述颗粒的内部组分相关。5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。6.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤足够快使得与获得所述颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒。7.如权利要求6所述的方法，其中所述延迟时间小于约20微秒。8.如权利要求1所述的方法，其中所述照射所述颗粒的步骤包括将所述颗粒暴露于光学辐射束，所述光学辐射束包括至少两个小束，每个小束具有所述至少两个光学频率之一，这样使得所述小束照射所述颗粒内的至少两个空间位置。9.如权利要求1所述的方法，其中所述至少两个空间位置是部分重叠的。10.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括用至少两种荧光标记将所述颗粒染色，其中每种标记被配置成响应于通过具有所述光学频率之一的辐射照射而发射荧光辐射。11.如权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括收集从所述标记发出的荧光信号并将其数字化以生成时间荧光波形，每个时间荧光波形对应于所述标记之一。12.如权利要求11所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光波形进行操作以获得所述荧光信号的共定位量度。13.如权利要求12所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述滤波波形进行积分以获得积分值，并且将所述积分值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。14.如权利要求12所述的方法，其中所述对所述波形进行操作的步骤包括将高通或带通滤波器应用于所述波形中的至少一个以生成至少一个滤波波形、随后将所述波形逐点相乘以生成合成乘法波形，对所述乘法波形进行积分以获得积分值，从所述积分值中减去背景值并按强度换算所述合成值以生成最终值，并且将所述最终值与预定阈值进行比较以获得所述共定位量度。15.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括获得沿着与所述流式细胞术系统中的颗粒流动的方向基本上垂直的方向的所述颗粒的侧向尺寸的估计。16.如权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括获得沿着与所述流式细胞术系统中的颗粒流动的方向平行的方向的所述颗粒尺寸的估计。17.如权利要求16所述的方法，其中通过将所述检测到的时间荧光数据平方，将带通滤波器应用于所述平方的荧光数据，将所述滤波数据进行积分，并将所述滤波数据与预定阈值进行比较来获得所述颗粒的所述侧向尺寸的所述估计。18.如权利要求17所述的方法，其中基于响应于所述照射步骤从所述颗粒发出的荧光辐射的脉冲的时距获得沿着与颗粒流动的方向平行的方向的所述颗粒尺寸的所述估计。19.如权利要求18所述的方法，所述方法进一步包括利用沿着与颗粒流动的方向平行和垂直的方向的所述颗粒尺寸的所述估计来获得所述颗粒的纵横比。20.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒包括以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。21.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。22.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞包括患病的细胞。23.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括利用所述颗粒的至少一个特征的所述估计来得出关于所述颗粒的分选决定。24.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤由计算机处理器执行。25.一种确定颗粒的特征的方法，所述方法包括：用射频调制的光束照射颗粒以便从所述颗粒引出荧光辐射和散射辐射中的任何一种，检测从所述颗粒发出的荧光辐射或散射辐射以生成时间荧光或散射波形数据，在并未基于任何所述荧光或散射波形数据生成所述颗粒的图像以获得所述颗粒的至少一个特征的估计的情况下，处理任何所述荧光和散射波形数据以获得所述至少一个特征的估计。26.如权利要求25所述的方法，其中所述处理步骤包括分析调制所述荧光波形数据的一个或多个拍频以获得所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。27.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒的所述特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。28.如权利要求25所述的方法，其中所述处理步骤足够快使得与获得所述颗粒的至少一个特征的所述估计相关的延迟时间小于约100微秒。29.如权利要求25所述的方法，所述方法进一步包括检测所述荧光辐射和所述散射辐射两者以生成荧光和散射波形数据，并且采用所述荧光波形数据获得所述颗粒在与颗粒流动的方向基本上垂直的方向上的侧向尺寸的估计，并采用所述散射波形数据获得所述颗粒在与所述流式细胞术系统中的颗粒流动的方向平行的方向上的尺寸的估计。30.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒包括以下中的任何一种：细胞、微囊泡、细胞碎片、脂质体、珠粒和小生物体。31.一种确定颗粒的特征的方法，所述方法包括：当颗粒流过流式细胞术系统时用射频调制的光束照射颗粒以便从所述颗粒引出至少一个辐射响应，检测从所述颗粒发出的所述辐射响应以生成与所述辐射响应相关的时间波形数据，在并未基于所述波形数据生成所述颗粒的图像的情况下处理所述波形以获得所述颗粒的至少一个特征的估计。32.如权利要求31所述的方法，其中所述辐射响应包括响应于所述照射而从所述颗粒发出的荧光辐射和散射辐射中的任何一种。33.如权利要求31所述的方法，其中所述射频调制的光束包括彼此分离至少一个射频的至少两个光学频率。34.如权利要求33所述的方法，其中所述处理步骤包括分析与在所述辐射响应中检测到的所述至少一个射频相关的至少一个拍频，以确定所述颗粒的所述至少一个特征的所述估计。35.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一个特征包括以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。36.如权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括利用所述颗粒的至少一个特征的所述估计来得出关于所述颗粒的分选决定。37.一种用于执行计算机辅助流式细胞术的方法，所述方法包括：将含有多个颗粒的样品引入流式细胞仪中，从一个或多个流式细胞仪测量值中获得所述多个颗粒的至少一个颗粒特征的估计，其中所述获得步骤包括当颗粒流过流式细胞仪时用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的辐射照射所述颗粒以从所述颗粒引出辐射响应，检测来自所述颗粒的所述辐射响应以生成与所述响应相关的时间波形数据，并且通过分析调制所述时间波形数据的一个或多个拍频来处理所述时间波形数据以获得所述至少一个颗粒特征的值，并且经由计算机处理器鉴别如下门控，所述门控指示所述颗粒特征的值在预定范围内的所述颗粒中的一个或多个。38.如权利要求37所述的方法，其中所述辐射响应包括荧光辐射和散射辐射中的任何一种。39.如权利要求37所述的方法，其中所述射频在约50MHz至约250MHz的范围内。40.如权利要求37所述的方法，其中所述颗粒特征是以下中的至少一个：所述颗粒的维度尺寸、所述颗粒沿两个不同维度的尺寸比率、由与所述颗粒相关的两种或更多种标记发射的荧光辐射的共定位、所述荧光辐射的点状度、所述荧光辐射的空间分布的量度、所述颗粒的位置或取向的量度、所述颗粒的偏心率的量度、所述颗粒与参考颗粒相似性的量度、所述颗粒的一个或多个空间傅里叶分量的组合、所述颗粒位于所述照射辐射焦点的程度的量度。41.一种用于在流式细胞术系统中分选细胞的方法，所述方法包括：用具有彼此偏移一个射频的至少两个光学频率的光学辐射束照射细胞以从所述细胞引出荧光辐射，检测所述荧光辐射以生成时间荧光数据，并且处理所述时间荧光数据以得出关于所述细胞的分选决定。42.如权利要求41所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述荧光数据进行操作以获得所述细胞的特征的估计并基于所述估计作出所述分选决定。43.如权利要求42所述的方法，其中所述处理步骤包括分析与所述时间荧光数据中的所述射频相关的至少一个拍频，以获得所述细胞的特征的所述估计。44.如权利要求41所述的方法，其中在并未基于所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克·迪博尔德，基根·奥斯利，乔纳森·林，
申请(专利权)人：贝克顿·迪金森公司，
类型：发明
国别省市：美国,US