从血液中检测细胞的个体化微过滤方法技术

本申请提供了一种基于毛细管数的从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，所述方法利用基于血液样本的血液流变学参数测量结果而确定的过滤参数。本申请还提供了一种确定微流体弹性过滤过程中的过滤参数的方法，所述微流体弹性过滤过程用于从个体的血液样本中分离循环稀有细胞。本申请还提供了用于执行本申请描述的方法的从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的设备以及非暂时性计算机存储介质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从血液中检测细胞的个体化微过滤方法交叉引用本申请要求2016年4月27日提交的美国临时专利申请62/328,171号和2016年8月29日提交的中国专利申请201610753136.9号的优先权，其中，2016年8月29日提交的中国专利申请201610753136.9号要求美国临时专利申请62/328,171号的优先权。通过援引方式将这两个申请整体并入本文。专利技术背景专利
本申请涉及从样本中分离和检测细胞。具体而言，本申请涉及对个体对象的循环稀有细胞(如循环肿瘤细胞(CTC))的个体化微过滤。相关技术描述癌症在全球范围内是首要死因，其中，癌症转移导致的死亡占癌症死亡总人数超过90％。循环肿瘤细胞(CTC)是指从实体瘤脱落并进入外周血液的癌细胞。从人类血液中检测CTC作为液体活检，相对非侵入式地进行癌症诊断和治疗监测。以CTC作为生物标志物，可以实现个体化治疗、理解转移过程、乃至靶向治疗方案。已经针对CTC检测开发出多种基于膜的微过滤系统。尽管普遍认为，与正常血细胞相比，CTC通常较大并且形变能力差，但是现有的对于微过滤系统的报道仍然仅仅关注尺寸差异(G.Vona,etal.AmJPathol,2000,156,57-63；I.Desitter,etal.AnticancerRes,2011,31,427-41；M.Hosokawa,etal.AnalyticalChemistry,2010,82,6629-35；M.Hosokawa,etal.PLoSONE,2013,8,e67466；S.Zheng,etal.JChromatogrA,2007,1162,154-61；R.A.Harouaka,etal.ClinChem,2014,60,323-33；L.S.Lim,etal.LabChip,2012,12,4388-96；S.J.Tan,etal.BiosensBioelectron,2010,26,1701-5；C.T.Lim,etal.BiomedMicrodevices,2009,11,883-92；H.Mohamed,etal.JChromatogrA,2009,1216,8289-95)。CTC与正常血细胞在力学性质上的差异——在细胞刚度或弹性方面，尚未被用于设计CTC检测的微过滤系统。包括对CTC微过滤捕获的理论建模、仿真以及实验研究在内的系统性研究对于开发优化的设计至关重要。然而，仅有少数研究致力于这样的基础性工作。一些实验研究展示了在具有不同的滤孔尺寸、孔隙率(openfactor)、流量、血液稀释度与样本预处理的不同微过滤系统中的癌细胞捕获结果，但是并未给出明确的设计准则或生物力学研究(F.A.W.Coumans,etal.PLoSONE,2013,8,e61774；F.A.W.Coumans,etal.PLoSONE,2013,8,e61770；D.L.Adams,etal.RSCadvances,2014,9,4334-42)。另一方面，有纯力学建模工作研究了CTC在穿过具有不同截面的五种滤孔时所受的压力，并突出说明圆形截面最适于高效分离CTC(Z.Zhang,etal.LabChip,2014)。Tai等提出了高效捕获具有高活性的癌细胞的方法，其中仅清楚地提供了实现高活性的定量方法，而没有给出具有高效率和高纯度的CTC捕获的清晰设计准则(Taietal.,US2012/0178097A1)。因此，仍然缺乏系统性研究来实现高效率和高纯度的CTC微过滤捕获。现有所有用于从癌症患者进行CTC检测的微过滤系统对不同患者使用一系列的固定和恒定参数，而没有考虑个体差异。已经广泛报道了癌症患者与健康对照组在全血液粘度上存在差异(A.Pinkowski,etal.bioRxiv,2015；S.O.Elusoji,etal.AfrJReprodHealth,2008,12,84-9；G.-F.vonTempelhoff,etal.ClinHemorheolMicrocirc,2001,26,55-61)。对癌症患者进行诸如手术和化疗的治疗也会改变他们的全血粘度(A.Pinkowski,etal.bioRxiv,2015；C.E.Omoti,etal.PakJMedSci,2007；M.Khan,etal.ClinHemorheolMicrocirc,1995,15,4)。血液粘度在确定微过滤系统的优化参数中起重要作用。但是，目前还没有提供考虑到个体差异的个体化微过滤系统。因此，仍需要开发实现具有高效率和高纯度的通过微过滤的CTC捕获方法以及个体化微过滤方法来克服以上缺点。本专利技术满足这些要求以及其他要求。专利技术概述在一方面，本申请提供了一种从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，包括以下步骤：任选地，对样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)，测量样本的血液流变学参数，基于血液流变学参数的测量结果，确定过滤参数，以及使用确定的过滤参数，对样本进行微过滤。在一些实施方案中，循环稀有细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。与循环肿瘤细胞相比，白细胞在存在于血液中的细胞中占比更高，并且尺寸更小。因此，本方法适用于将循环肿瘤细胞与白细胞分离。在一些实施方案中，个体患有肿瘤或被怀疑患有肿瘤。在一些实施方案中，个体是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、宫颈癌、肾癌、头颈癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑肿瘤、胸膜间皮瘤以及未知原发癌。在一些实施方案中，预处理步骤包括使样本与RBC裂解缓冲液接触。应当理解，预处理步骤是任选的。在一些实施方案中，血液样本是全血样本。在这种情况下，尽可能多地从样本中除去红细胞是有利的。在一些实施方案中，血液样本已经过去除红细胞的步骤处理。在这种情况下，预处理步骤不是必需的。本方法的目的之一是基于不同个体之间血液样本的不同血液流变学特性，提供从血液样本中对循环稀有细胞的有效分离。在一定程度上，本方法提供了基于来自指定个体的血液样本的独特血液流变学特性来分离循环稀有细胞的个体化策略。在一些实施方案中，血液流变学参数包括样本粘度、循环稀有细胞的平均刚度、循环稀有细胞的平均直径、以及它们的任意组合。应该理解，在本领域中还存在其他可用且可测量的血液流变学参数。任何适用于本申请的方法的血液流变学参数都可以被选择。基于血液流变学参数的测量结果而确定的过滤参数可包括多种形式的参数，包括但不限于流速、滤孔尺寸、孔隙率和尺寸，以及过滤通量。本领域技术人员能够理解，过滤参数可以通过各种参数并且以各种方式表征。一些参数是独立的，例如滤孔尺寸。一些参数，例如过滤通量，取决于一系列其它参数。因此，本申请中的过滤参数可以以一般方式理解，并且可以包括过滤过程中涉及的参数的任何适当组合。本申请的专利技术人建立了如下所示的参数，即，毛细管数(Ca)，其可用于预测过滤效率：其中V是微过滤步骤中的平均流速，单位为mm/s；μ是样本粘度，单位为mPa·s；σ是循环稀有细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，包括以下步骤：任选地，对所述样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)，测量所述样本的血液流变学参数，基于血液流变学参数的测量结果确定过滤参数，使用确定的过滤参数，对所述样本进行微过滤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.27 US 62/328,1711.一种从个体的血液样本中分离循环稀有细胞的方法，包括以下步骤：任选地，对所述样本进行预处理以去除至少一部分红细胞(RBC)，测量所述样本的血液流变学参数，基于血液流变学参数的测量结果确定过滤参数，使用确定的过滤参数，对所述样本进行微过滤。2.如权利要求1所述的方法，其中所述循环稀有细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有肿瘤或疑似患有肿瘤。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预处理步骤包括使所述样本与RBC裂解缓冲液接触。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血液流变学参数包括样本粘度、循环稀有细胞的平均刚度、循环稀有细胞的平均直径，以及上述的任何组合。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤参数被确定为使如下定义的毛细管数(Ca)为0.02-0.04，优选0.03-0.04：其中V是微过滤步骤中的平均流速，单位为mm/s；μ是样本粘度，单位为mPa·s；σ是循环稀有细胞的平均刚度，单位为mN/m。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤参数包括滤孔直径，其为循环稀有细胞平均直径的大约1/2。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱，以电学方式鉴定微过滤步骤捕获的细胞的步骤。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括通过使用纳米尖端电极的电化学阻抗谱，以电学方式检测外泌体中的蛋白质和/或miRNA的步骤，其中所述外泌体分离自所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贻昆，赵聪，卡世夫·里亚兹，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81