The present disclosure provides methods for separating target nucleated cells (e.g. fetal mesenchymal stem cells) from non-nucleated red blood cells, cell populations obtained by the present disclosure method, and methods for detecting fetal abnormalities and treating stem cells using separated target nucleated cells and their offspring.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离有核细胞和有核细胞群的方法及其应用1.相关申请的交叉引用本申请要求2016年4月7日提交的美国临时申请62/319,523号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。2.
技术介绍
回收在外周血中循环的有核细胞(NC)(例如，在母体血液中循环的胎儿细胞，在临床缓解的患者的血液中循环的癌细胞，干细胞，内皮细胞和/或其他非常罕见的细胞)的主要障碍是单次血液收集物中这些细胞的总数非常低。获得NC的第一个挑战是外周血和非外周血中无核红细胞(RBC)的数量超过非常需要的NC。例如，每1ml母体血液中的胎儿细胞数为2-6，这是1000000-3000000个有核母体细胞中有1个胎儿细胞，和1000000000-2000000000个红细胞中有1个胎儿细胞的比例。Krabchi等，2001，Clin.Genet.60:145-150。在诸如脐带血(UCB)等非外周血中，NC与RBC的比率为约1000比1。已经设计了许多方法旨在获得稀有的NC母体血液。然而，在血液中存在的大量细胞中发现稀有的NC具有挑战性，特别是以保持其功能的方式。大多数NC富集方法的第一步需要从含有NC的血液样品中去除RBC。通常，为了减少封闭或开放系统中RBC的数量和血浆体积，进行涉及添加或不添加外源介质的手动或半自动离心的方法，所述介质例如蔗聚糖(ficoll)、胶体二氧化硅颗粒(percoll)、羟乙基淀粉(HES)、葡聚糖、聚明胶肽(poligeline)和明胶。然而，这些方法在最终产物体积、残余RBC、细胞活力以及NC回收、单个核细胞(MNC)、CD34+细胞、集落形成单位细胞(CFU)和长期培养起...
【技术保护点】
1.一种将血液来源的有核细胞富集级分中存在的目标有核细胞的群与无核红细胞分离的方法，所述有核细胞富集级分含有不超过20％的来自血液的无核红细胞，所述方法包括对所述有核细胞富集级分进行以下步骤中的至少一种：a)针对所述目标有核细胞的阴性选择；b)针对所述目标有核细胞的阳性选择；和c)密度梯度离心，从而分离目标有核细胞的群。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.07 US 62/319,5231.一种将血液来源的有核细胞富集级分中存在的目标有核细胞的群与无核红细胞分离的方法，所述有核细胞富集级分含有不超过20％的来自血液的无核红细胞，所述方法包括对所述有核细胞富集级分进行以下步骤中的至少一种：a)针对所述目标有核细胞的阴性选择；b)针对所述目标有核细胞的阳性选择；和c)密度梯度离心，从而分离目标有核细胞的群。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述有核细胞富集级分含有：a)至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的来自血液的有核细胞；和/或b)不超过15％、不超过10％、不超过5％、或不超过1％的来自血液的无核红细胞。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述有核细胞富集级分是包括以下步骤的方法的产物：a)在局部重力下在容器的内腔中将包含有核细胞、无核红细胞和凝集剂的混合物分离成有核细胞富集级分和无核红细胞富集级分，其中所述分离分批进行，并且其中i.所述内腔中所述混合物的平均高度不超过4cm；和/或ii.对所述内腔中所述混合物的平均高度进行选择，从而在不超过3轮、不超过2轮或不超过1轮分离之后提供无核红细胞富集级分，其含有所述混合物中至少80％的所述无核红细胞和/或所述混合物中不超过20％的所述有核细胞；b)可选地重复步骤(a)一次或多次；和c)可选地洗涤所述有核细胞富集级分一次或多次。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述洗涤包括浓缩所述有核细胞富集级分的细胞，并将经浓缩细胞与包含血浆的溶液合并，可选地，其中所述血浆是自体血浆。5.如权利要求3或4所述的方法，其中，所述内腔中所述混合物的平均高度为：a)不超过4cm，不超过3.5cm，不超过3cm，不超过2.5cm，不超过2cm，不超过1.5cm，或不超过1cm；和/或b)至少0.5cm或至少1cm。6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中，所述混合物的体积为：a)小于500mL，小于400mL，小于300mL，小于200mL，小于100mL，小于75mL，小于50mL，小于40mL，小于30mL或小于25mL；b)至少5mL，至少10mL，至少20mL或至少25mL；c)a)和b)的任何组合；或d)25mL至50mL，50mL至100mL，100mL至200mL，或200mL至400mL。7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中，所述凝集剂是葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)、明胶、喷他淀粉、蔗聚糖、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺或其任何组合。8.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中，所述分离进行2至15分钟，2至10分钟，2至5分钟，3至6分钟，4至12分钟，5至10分钟，2至8分钟，4至10分钟，3至7分钟，6至10分钟或5至8分钟。9.如权利要求3至8中任一项所述的方法，其中，所述容器的所述内腔：a)具有固定体积；b)包括漏斗形部分；c)包括圆柱形部分或多面体部分，可选地，其中所述圆柱形部分或多面体部分：(i)在底端连接至漏斗形部分；(ii)在一个顶端连接至倒置的漏斗形部分；或(iii)在底端连接至漏斗形部分，并且在顶端连接至倒置的漏斗形部分；或者d)a)-c)的任何组合。10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其中，容器包括可操作地连接至所述容器的内腔的一个或多个入口/出口，可选地还包括位于所述容器的内腔内的一个或多个偏流器，以使通过所述一个或多个入口/出口引入所述容器的内腔中的流体偏转并提供流体层流。11.如权利要求10所述的方法，其中，生产有核细胞富集级分的所述方法还包括通过位于所述内腔的底部的第一入口/出口将重质液体引入到所述容器的内腔中，直到全部或一部分的有核细胞富集级分通过位于所述内腔的顶部的第二入口/出口被迫排出所述内腔，可选地，其中：a)在分离所述混合物期间，一定量的所述重质液体存在于所述容器的内腔中；b)所述重质液体包含全氟三丁胺、Ficoll1.077g/mL、Ficoll1.085g/mL，或其任何组合；或者c)a)和b)的组合；可选地，其中在a)至c)的任一项中，在生产有核细胞富集级分的方法中，在将一定量的重质液体引入所述容器中之后将所述混合物引入所述容器的内腔中，可选地，其中生产有核细胞富集级分的方法包括在将所述混合物引入所述容器的内腔之前将一定量的重质液体引入所述容器中的步骤。12.如权利要求3至11中任一项所述的方法，其中，生产有核细胞富集级分的方法包括将所述混合物引入所述容器的内腔中的步骤。13.如权利要求3至12中任一项所述的方法，其中，所述混合物是包括将所述凝集剂或包含所述凝集剂的溶液与包含所述有核细胞和所述无核红细胞的样品合并的方法的产物，可选地，其中生产有核细胞富集级分的方法还包括形成所述混合物的步骤。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述样品：a)是先前制备的有核细胞富集级分；b)包含全血；c)包含血液级分，可选地，其中i)A)所述血液级分含有用于制造所述血液级分的一定量的全血中存在的至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或超过50％的血浆；或B)所述血液级分含有用于制造所述血液级分的一定量的全血中存在的5-10％、10-20％、20-30％、20-50％或50-100％的血浆；和/或ii)所述血液级分是包括下述步骤的方法的产物：(1)可选地，用水性溶液稀释血液；(2)将血液或来自步骤(1)的经稀释的血液离心以获得细胞沉淀物；和(3)可选地，将所述沉淀物重悬于水性溶液中，该水性溶液具有与步骤(1)的水性溶液相同的组成或具有与步骤(1)的水性溶液不同的组成，从而形成所述血液级分；或者d)包含用水性溶液稀释的血液。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述水性溶液包含血浆、细胞培养基、缓冲液或其组合，可选地，其中所述细胞培养基是RoswellPar...
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