一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法技术

本发明专利技术公开了一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，选取黄姑鱼，采用三针法注射，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，然后滴在干净玻片上老化，制得老化的玻片；用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针；将老化的玻片在甲酰胺中变性，再用乙醇脱水制得已变性的玻片；将FISH探针变性；将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，恒温箱中杂交；再经放大、洗涤、信号检测即可。本发明专利技术提供一种简便方法能够使黄姑鱼染色体呈现特异的荧光分布特征，提高黄姑鱼染色体辨识的效率与准确性，解决黄姑鱼染色体辨识标志贫乏的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法
本专利技术涉及染色体分析
，具体是一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法。
技术介绍
染色体是遗传物质的载体。染色体分析是遗传学研究的重要内容。染色体的分辨和识别是研究染色体的基础。传统染色体识别主要依靠臂比和染色体相对长度两个参数来分辨同源染色体与非同源染色体。在高等脊椎动物中发展起来的G带技术可以使染色体延纵轴显示明暗相间的条纹，其中同源染色体条纹特征相似，而非同源染色体的条纹特征不同。因此，G带显示提高了染色体的识别与配对的效率与准确性。然而，由于鱼类基因组结构和高等脊椎动物存在差异，目前成功显示G-带的例子很少。在黄姑鱼中，尚未见成功显示G带或其他多重带的报道。基于染色体特异探针的FISH，可以使同源染色体呈现相似的荧光分布特征，而非同源染色体呈现不同的荧光分布特征，同样也可以用于辅助染色体识别与配对。然而，由于分离染色体特异探针成本高，研发周期长，目前鱼类尚未见相关报道。目前，用于辨识黄姑鱼染色只能依赖臂比、相对长度、核仁组织区域位置等少数形态特征。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄姑鱼染色体辨识的效率与准确性的显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，步骤如下：一、染色体制备选取黄姑鱼，采用三针法注射；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.6-1.0ml党参煎汁液和BSA的混合液，注射第一针15h后注射第二针；第三针是在取样前2.5h按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.08-0.12ml秋水仙素；剖去黄姑鱼的头、肾，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，制得细胞悬液，-40℃保存；取细胞悬液，滴在干净玻片上，60℃老化2.5-3.5h，制得老化的玻片；二、提取黄姑鱼鳍条DNA用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；三、制备FISH探针用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针长度在200-750bp之间；四、基因组荧光原位杂交1）玻片变性：将老化的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺中变性2.5min，再依次用质量浓度为70%、80%、90%、100%、100%的乙醇分别脱水，制得已变性的玻片；2）FISH探针变性：将制备好的FISH探针加入到杂交缓冲液HB中，使得终浓度为1.5-2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰块上，制得变性的FISH探针；3）杂交：将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，用封口膜封上，于37℃恒温箱中杂交12-16h；4）放大：杂交后取出，室温放置0.8-1.2h后，依次使用体积浓度为10%的甲酰胺溶液、4×SSC、4×SSC各洗涤5min，室温晾干后加AV到玻片上有FISH探针的地方37℃孵育；5）洗涤：孵育后取出，依次用2*T-SSC、4×SSC、4×SSC暗处洗涤；6）信号检测：室温晾干后用PI（无机磷酸盐）进行复染，指甲油封片，然后用荧光显微镜完成显微观察与拍照；通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的电荷藕合器件图像传感器拍摄图像，利用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。作为本专利技术进一步的方案：步骤一中混合液是将50g党参煎熬至最终体积为50ml，再加入0.405gNaCl和125mg的BSA混匀后制得。作为本专利技术进一步的方案：KCl溶液的浓度为0.075mol/l。作为本专利技术进一步的方案：步骤一中固定液采用卡诺氏固定液。作为本专利技术进一步的方案：步骤二中细胞/组织基因组DNA提取试剂盒采用GK0121。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中体积浓度为80%的甲酰胺包含12ml甲酰胺、1.5ml20×SSC与1.5ml灭菌水。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中杂交缓冲液HB含有杂交基础缓冲液、去离子甲酰胺与50%硫酸葡聚糖。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中AV是终浓度为4μg/ml的Avidin-Alexafluor-488，488标记的兔抗亲和素。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中荧光显微镜采用OlympusBX53荧光显微镜。作为本专利技术进一步的方案：步骤四中PI的终浓度为1μg/ml。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种简便方法能够使黄姑鱼染色体呈现特异的荧光分布特征，提高黄姑鱼染色体辨识的效率与准确性，解决黄姑鱼染色体辨识标志贫乏的问题。附图说明图1是基于FISH的黄姑鱼染色体核型图。a.雌性黄姑鱼FISH；b.雄性黄姑鱼FISH；c.雌性黄姑鱼染色体核型图；d.雄性黄姑鱼染色体核型图；e.雌性黄姑鱼染色体荧光信号3D光密度图；f.雄性黄姑鱼染色体荧光信号3D光密度图，标尺=5μm。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本专利技术实施例中，一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，步骤如下：1、染色体制备选取体重为400g的黄姑鱼，采用三针法注射，每次注射完于25℃海水中暂养；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.8ml党参煎汁液和BSA的混合液（党参50g煎熬至最终体积为50ml，加入0.405gNaCl和125mg的BSA混匀），15h后注射第二针；取样前2.5h于胸鳍基部注射0.1ml/100g秋水仙素；剖去头肾，用0.075mol/l的KCl溶液低渗40min，再用卡诺氏固定液固定3次，-40℃保存；玻片变性前取细胞悬液，滴在有一层薄雾的干净玻片上，60℃老化3h。2、黄姑鱼鳍条DNA提取用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（GK0121）提取黄姑鱼鳍条DNA。3、FISH探针制备用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA（总体积20μl：切口平移杂交缓冲液10μl，3μl的DNA（1μg），Polymerase聚合酶0.4μl（Thermo，EP0041），DnaseI（脱氧核糖核酸酶I）1μl(其中DnaseI0.7mU，mU是酶的活性单位，即1微摩尔的底物所需的酶量)，剩余加灭菌水5.6μl）；14.5℃反应90min，使得FISH探针长度在200-750bp之间。4、基因组荧光原位杂交（FISH）1）玻片变性：将老化好的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺（12ml甲酰胺,1.5ml20×SSC（柠檬酸钠缓冲液），1.5ml灭菌水）中变性2.5min，系列乙醇脱水各30s（70%，80%，90%，100%，100%）。2）FISH探针变性：将制备好的黄姑鱼基因组FISH探针加入到杂交缓冲液HB中(杂交基础缓冲液，去离子甲酰胺，50%硫酸葡聚糖)，使得终浓度为1.5-2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰上10min。3）杂交：将变性好的FISH探针（共35μl）加入到已变性好的玻片上，用封口膜封上，置于暗盒中于37℃恒温箱杂交12h。4）放大：12h后取出，室温放置1h，[10%甲酰胺（10%FA）,4×SSC，4×SSC]各洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤如下：一、染色体制备选取黄姑鱼，采用三针法注射；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.6‑1.0ml党参煎汁液和BSA的混合液，注射第一针15h后注射第二针；第三针是在取样前2.5h按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.08‑0.12ml秋水仙素；剖取黄姑鱼的头肾，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，制得细胞悬液，‑40℃保存；取细胞悬液，滴在干净玻片上，60℃老化2.5‑3.5h，制得老化的玻片；所述党参煎汁液和BSA的混合液是将50g党参煎熬至最终体积为50ml，再加入0.405g NaCl和125mg的BSA混匀后制得；二、提取黄姑鱼鳍条DNA用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；三、制备FISH探针用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针长度在200‑750bp之间；四、基因组荧光原位杂交1）玻片变性：将老化的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺中变性2.5min，再依次用质量浓度为70%、80%、90%、100%、100%的乙醇分别脱水，制得已变性的玻片；2）FISH探针变性：将制备好的FISH探针加入到杂交缓冲液HB中，使得终浓度为1.5‑2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰块上，制得变性的FISH探针；所述杂交缓冲液HB含有杂交基础缓冲液、去离子甲酰胺与50%硫酸葡聚糖；3）杂交：将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，用封口膜封上，于37℃恒温箱中杂交12‑16h；4）放大：杂交后取出，室温放置0.8‑1.2h后，依次使用体积浓度为10%的甲酰胺溶液、4×SSC、4×SSC各洗涤5min，室温晾干后加AV到玻片上有FISH探针的地方37℃孵育；其中，AV为4μg/ml的Avidin‑Alexa fluor‑488标记的兔抗亲和素；5）洗涤：孵育后取出，依次用2×T‑SSC、4×SSC、4×SSC暗处洗涤；6）信号检测：室温晾干后用碘化丙啶PI进行复染，指甲油封片，然后用荧光显微镜完成显微观察与拍照；通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的电荷藕合器件图像传感器拍摄图像，利用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。...

【技术特征摘要】
1.一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤如下：一、染色体制备选取黄姑鱼，采用三针法注射；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.6-1.0ml党参煎汁液和BSA的混合液，注射第一针15h后注射第二针；第三针是在取样前2.5h按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.08-0.12ml秋水仙素；剖取黄姑鱼的头肾，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，制得细胞悬液，-40℃保存；取细胞悬液，滴在干净玻片上，60℃老化2.5-3.5h，制得老化的玻片；所述党参煎汁液和BSA的混合液是将50g党参煎熬至最终体积为50ml，再加入0.405gNaCl和125mg的BSA混匀后制得；二、提取黄姑鱼鳍条DNA用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；三、制备FISH探针用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针长度在200-750bp之间；四、基因组荧光原位杂交1）玻片变性：将老化的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺中变性2.5min，再依次用质量浓度为70%、80%、90%、100%、100%的乙醇分别脱水，制得已变性的玻片；2）FISH探针变性：将制备好的FISH探针加入到杂交缓冲液HB中，使得终浓度为1.5-2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰块上，制得变性的FISH探针；所述杂交缓冲液HB含有杂交基础缓冲液、去离子甲酰胺与50%硫酸葡聚糖；3）杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡明夷，郑娇，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建,35