一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，其中，所述的单链抗体hCD46scFV与其他结构由连接肽所连接。本发明专利技术还公开了靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体以及慢病毒。本发明专利技术还公开了该嵌合抗原受体的应用。该嵌合抗原受体中的scFV具有抗人CD46的特异性，能特异性结合到靶抗原上，通过联合重组腺病毒的使用发挥针对结直肠癌细胞的细胞毒效应，所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于表面CD46阳性的肿瘤治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种靶向CD46的人源嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
设计一种活体之外能够产生自身抗原特异性的T细胞，通过肿瘤靶向特异性的T细胞介导免疫反应是肿瘤治疗的方法的研究方向。目前，已证实的肿瘤靶向的特异性T细胞分离及转移已经在治疗黑色素瘤、血液肿瘤中取得了不错的临床结果。嵌合抗原受体(CAR，chimericantigenreceptor)是通过外源性的基因转导技术使T细胞获得新的特异性。CAR作为一种合成受体，是由能够识别肿瘤相关的特异性抗原scFV(由抗体中的VL区域氨基酸序列与VH区域氨基酸序列通过Linker相连组成)，通过其铰链结构与具有活化T细胞的功能的一个或者多个信号转导区域相关的靶向部位结合，使scFV由跨膜区域与T细胞中活化增殖的信号区域偶联，通过scFV来识别肿瘤的特异性抗原，产生活化T细胞的信号，再回输到患者体内，活化增殖的T细胞能够通过非MHC限制性模式展现较强的抗肿瘤能力。第一代CAR技术的信号转导结构区域源自CD3zeta的细胞质部分区域或者Fc受体的γ链。然而，第一代的CAR受体中缺少T细胞共刺激信号，导致T细胞的激活只能发挥其瞬间效应，在体内具有存活时间较短、细胞因子的分泌少等不足。第二代的CAR在第一代的基础上增加了共刺激信号分子的细胞内结构区域，提供了能够活化T细胞的两种信号，包括CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB等，提高了CAR改造T细胞的存活率以及增殖率，并且增强了细胞因子的分泌功能，从而能够突破肿瘤的微环境中存在的免疫抑制。CAR-T目前在血液系统肿瘤中应用最为广泛，并且临床疗效确切(CD19，CD20)，但是在实体瘤上的临床研究相对较少，针对实体瘤的治疗，CAR-T细胞治疗技术遇到了的技术瓶颈为特异性靶点较少，T细胞无法有效浸润及肿瘤内部免疫抑制性。CD46是一种具有跨膜结构的细胞调节蛋白，是肿瘤中较特异的标志物。其在多种实体肿瘤中都有较高的表达，如膀胱癌，卵巢癌，乳腺瘤，结直肠癌等。CD46的表达强度与肿瘤的恶性程度，上皮间质转化以及转移有关。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体的scFV区域有抗人的CD46特异性，能够特异性的结合在靶抗原上，从而发挥其针对结直肠癌细胞的细胞毒作用，所述的嵌合抗原受体同时能对T淋巴细胞进行修饰，T细胞经过修饰后可以用于癌细胞表面CD46阳性肿瘤治疗，尤其对结直肠癌细胞具有特异性的杀伤作用。本专利技术首次报道CD46在结直肠癌中特异性表达增加，CD46的表达强度与肿瘤的恶性程度相关，且在结直肠癌细胞表面高表达。因此，CD46是一种可以用于结直肠癌等肿瘤的免疫治疗的潜在靶抗原。而鼠源的抗体直接输入人体后会产生宿主抗移植物反应，严重影响修饰后T细胞针对CD46阳性的肿瘤细胞的杀伤能力。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的制备方法。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。本专利技术解决的技术问题是靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的同时联合使用重组腺病毒，该重组腺病毒表达调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(regulatedonactivationnormalTcellexpressedandsecreted，RANTES，NM_002985.2)和白细胞介素-15(interleukin15,IL-15，NM_000585.4)，RANTES和IL-15可促进T细胞的增殖及迁移，增强car-修饰T细胞在实体肿瘤中的功能。本专利技术还要解决的技术问题是提供了靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体在制备检测CD46阳性的肿瘤试剂或治疗CD46阳性的肿瘤药物方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒，其包含所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。技术方案：为了解决上述问题，本专利技术的技术方案是提供了所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，所述T细胞刺激信号转导结构为人CD8铰链区及CD8跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，所述单链抗体hCD46scFV与CD8铰链区通过连接肽连接。该靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体其结构如图1所示。其中，上述单链抗体hCD46scFV中，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示，所述重链和轻链通过GGGGSGGGGSGGGGS连接。其中，上述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体由针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV、CD8铰链区及跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成hCD46scFV-CD8Hinge-CD8membrane-CD137-CD3zeta。其中，上述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。其中，上述连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。其中，上述单链抗体hCD46scFV的5’端含有信号肽CD8a，该信号肽的氨基酸序列为MALPVTALLLPLALLLHAARP所示。一种含有所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。尤其是含有嵌合抗原受体hCD46scFV-CD8Hinge-CD8membrane-CD137-CD3zeta编码基因的表达载体。一种含有所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒。本
技术实现思路
还包括所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的表达载体的慢病毒的包装方法，包括以下步骤：1)针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV的获得；2)嵌合抗原受体hCD46-CAR抗人慢病毒质粒的构建；3)慢病毒的包装、浓缩及滴度测定。其中，上述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体制备检测CD46阳性的肿瘤试剂或治疗CD46阳性的肿瘤药物方面的应用。本专利技术所述的嵌合抗原受体能够用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞用于表面CD46阳性的肿瘤治疗。其中，上述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体在制备检测直肠癌试剂或治疗结直肠癌药物方面的应用。一种检测试剂盒，其包含所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体。鼠源的单链抗体在输注人体后，会产生宿主抗移植物反应(HAMA)，严重影响修饰后的T细胞对CD46阳性肿瘤细胞的杀伤作用，本专利技术针对抗鼠CD46单克隆抗体的scFV基因序列，采用框架置换及随机突变的方案，将CDR区氨基酸与人源的框架进行组合，构建人源化的抗体序列，并通过重叠延伸PCR技术加入linker形成抗人CD46特异性scFV，人源化的单链抗体hCD46LC2scFV将抗体中的框架区替换为人源的氨基酸序列，可以最大程度额避免HAMA。其中，所述鼠源CD46单克隆抗体的scFV轻链氨基酸序列参见序列表中的S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，所述T细胞刺激信号转导结构为人CD8铰链区及CD8跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，所述单链抗体hCD46scFV与CD8铰链区通过连接肽连接。

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体含有针对人CD46抗原的单链抗体hCD46scFV和T细胞刺激信号转导结构，所述T细胞刺激信号转导结构为人CD8铰链区及CD8跨膜结构，CD137和人CD3zeta胞内区结构串联组成的结构域，所述单链抗体hCD46scFV与CD8铰链区通过连接肽连接。2.根据权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述单链抗体hCD46scFV中，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示，所述重链和轻链通过GGGGSGGGGSGGGGS连接。3.根据权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。4.根据权利要求1所述的靶向CD46基因的人源嵌合抗原受体，其特征在于，所述连接肽的核苷酸列如SEQIDNO.6所示。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，吴炯，孟庆涛，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32