一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸有关物质的检测方法，包括色谱条件与系统适用性试验和L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸有关物质的测定；按外标法以峰面积计算2‑酮基戊二酸、（S）‑2‑乙酰氨基戊二酸和（E）‑2‑丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量。本发明专利技术检验方法具有较高的灵敏度、准确度、精密度，耐用性强，可准确反映L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料药有关物质的含量，适合工业上用于L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸有关物质的检测及质量控制，从而为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用的安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法
本专利技术属于食品和药物分析
，具体涉及一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法。
技术介绍
L-2-氨基-5-胍基戊酸(CAS登录号为74-79-3)属于氨基酸类化合物，具有重要的生理功能，常作为营养补充剂，也是氨基酸胶囊和输液的重要成分。L-2-氨基-5-胍基戊酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染；有利于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护患者的康护。临床上，L-2-氨基-5-胍基戊酸适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症；用于婴幼儿补充L-2-氨基-5-胍基戊酸缺乏。目前，L-2-氨基-5-胍基戊酸主要采用微生物发酵法生产，其代谢过程中会产生大量有机酸类同系物杂质(见图1)，是L-2-氨基-5-胍基戊酸原料药有关物质的主要来源。难于彻底分离除去的主要包括2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸等，易于残存于L-2-氨基-5-胍基戊酸原料中，影响产品质量。现行版各国药典收载的L-2-氨基-5-胍基戊酸均没有设置有关物质检查项，不能说清楚这些有机酸类同系物杂质在L-2-氨基-5-胍基戊酸原料药中的存在状况，也不利于利用该原料所制备制剂的质量控制，给临床用药带来安全隐患。现有技术没有涉及L-2-氨基-5-胍基戊酸原料的有关物质，尤其是2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸等代谢同系物杂质的定量检测。因此，非常有必要建立一个有关物质检测方法，对微生物发酵来源的L-2-氨基-5-胍基戊酸原料药进行全面的杂质检测和控制。本申请利用高效液相色谱技术建立了一种能够定量检测L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，该方法具有分离度好、灵敏度高、操作简便等诸多优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的高效液相色谱检测方法，为L-2-氨基-5-胍基戊酸的质量标准制定提供依据，以便更好控制产品质量，确保食用和药用安全。实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案实现：一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法：1、色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/mL的缓冲盐溶液(pH值2.0～2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟0.3～0.8mL；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μL；取系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，L-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按L-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；其中，系统适用性试验溶液为L-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的混合溶液；2、L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量；所述供试品溶液为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料加稀释液溶解制成的溶液；所述对照品溶液为由2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的溶液；所述对照溶液为供试品溶液加稀释液稀释制成的溶液。进一步，所述对照品溶液中2-酮基戊二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(S)-2-乙酰氨基戊二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(E)-2-丁烯二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×104～2×105；所述对照溶液与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104。优选的，L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其步骤包括：1)缓冲盐溶液的制备：称取一定量的磷酸盐或柠檬酸盐或醋酸盐，加水制成浓度为1～20mg/mL的溶液，再用对应的酸调节溶液的pH值为2.0～2.8，作为缓冲盐溶液；2)稀释液的制备：取步骤1)所得的缓冲盐溶液，加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液；3)供试品溶液的制备：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为1.0～50.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液；4)对照品溶液的制备：精密称取2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种，用稀释液溶解并稀释成制成浓度分别为2.5μg/mL、2.5μg/mL和0.25μg/mL的溶液，作为对照品溶液；5)对照溶液的制备：取步骤3)所得的供试品溶液，用稀释液稀释成制成L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为供试品溶液浓度千分之一的溶液，作为对照溶液；6)系统适用性溶液的制备：分别称取L-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种各适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml中约含L-2-氨基-5-胍基戊酸2.5mg、2-酮基戊二酸2.5μg、(S)-2-乙酰氨基戊二酸2.5μg与(E)-2-丁烯二酸0.25μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；7)空白溶剂的制备：取步骤2)所得的稀释液作为空白溶剂；8)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/mL的缓冲盐溶液(pH值2.0～2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟0.3～0.8mL；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μL；取步骤6)制备的系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，L-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按L-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；9)L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取步骤3)、4)和5)所制备的供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量。进一步，L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其优化的步骤包括：1)缓冲盐溶液的制备：称取一定量的磷酸二氢钠，加水制成浓度为3～10mg/mL的溶液，再用对应的酸调节溶液的pH值为2.0～2.5，作为缓冲盐溶液；2)稀释液的制备：取步骤1)所得的缓冲盐溶液，加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液；3)供试品溶液的制备：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为2.5～5.0mg/mL的溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法：1)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/mL的缓冲盐溶液(pH值2.0～2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟0.3～0.8mL；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μL；取系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸峰计算不低于3000；其中，系统适用性试验溶液为L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸与2‑酮基戊二酸、(S)‑2‑乙酰氨基戊二酸和(E)‑2‑丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的混合溶液；2)L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸有关物质的测定：取供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2‑酮基戊二酸、(S)‑2‑乙酰氨基戊二酸和(E)‑2‑丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量；所述供试品溶液为L‑2‑氨基‑5‑胍基戊酸原料加稀释液溶解制成的溶液；对照品溶液为由2‑酮基戊二酸、(S)‑2‑乙酰氨基戊二酸和(E)‑2‑丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的溶液；对照溶液为供试品溶液加稀释液稀释制成的溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法：1)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/mL的缓冲盐溶液(pH值2.0～2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B；流速为每分钟0.3～0.8mL；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μL；取系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，L-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按L-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；其中，系统适用性试验溶液为L-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的混合溶液；2)L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量；所述供试品溶液为L-2-氨基-5-胍基戊酸原料加稀释液溶解制成的溶液；对照品溶液为由2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的溶液；对照溶液为供试品溶液加稀释液稀释制成的溶液。2.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，所述稀释液的制备：取缓冲盐溶液加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液。3.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液；其制备方法为：称取一定量的磷酸盐或柠檬酸盐或醋酸盐，加水制成浓度为1～20mg/mL的溶液，再用对应的酸调节溶液的pH值为2.0～2.8。4.根据权利要求1所述L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中2-酮基戊二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(S)-2-乙酰氨基戊二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(E)-2-丁烯二酸的浓度与供试品溶液L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×104～2×105；所述对照溶液与供试品溶液中L-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104。5.根据权利要求1～4所述L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，具体步骤包括：1)缓冲盐溶液的制备：称取一定量的磷酸盐或柠檬酸盐或醋酸盐，加水制成浓度为1～20mg/mL的溶液，再用对应的酸调节溶液的pH值为2.0～2.8，作为缓冲盐溶液；2)稀释液的制备：取步骤1)所得的缓冲盐溶液，加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液；3)供试品溶液的制备：精密称取L-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为1.0～50.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液；4)对照品溶液的制备：精密称取2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种，用稀释液溶解并稀释成制成浓度分别为2.5μg/mL、2.5μg/mL和0.25μg/mL的溶液，作为对照品溶液；5)对照溶液的制备：取步骤3)所得的供试品溶液，用稀释液稀释成制成L-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为供试品溶液浓度千分之一的溶液，作为对照溶液；6)系统适用性溶液的制备：分别称取L-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(S)-2-乙酰氨基戊二酸和(E)-2-丁烯二酸的一种或多种各适量...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈程俊，李绪全，刘红，方佳茂，陈伟滨，林晓群，张松浩，陈榕兴，
申请(专利权)人：广东盛泰华生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44