一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法技术

本发明专利技术提供一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，合理优化灌流操作，并采用新型灌流液和灌流助剂，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任‑洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。本发明专利技术易于实施、操作简便、结果明确，且有效缩短操作时间，易于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法
本专利技术涉及细胞观察
，具体涉及一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法。
技术介绍
目前，观察血管干细胞、内皮前体细胞的方法主要为体内观察法：局部植入或静脉输入荧光标记(如GFP、CM-Dil等标记)的细胞，于不同时间段，取待测靶血管进行观察；或植入/输入其他方式标记(如BrdU)的细胞，于不同时间段，取血管标本，用组织化学、荧光免疫组织化学等方法观察、评价。这两种方法共同缺点有：①不能实时观察，观察时间点的选择有盲目性和随意性，观察点的取舍有随机性，从而影响评价的准确性；②了解细胞归巢、黏附动态变化、影响因素难度大，需投入较大的时间和成本。用超顺磁性氧化铁(造影剂)标记细胞磁共振成像可在体原位实时观察细胞附壁，但超顺磁性氧化铁有细胞毒性，如何解读观察结果仍存在争议。此外，还出现了体外观察方法，如专利ZL201310156400.7公开了“一种观察血管干细胞附壁的方法”，包括以下步骤：1)取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；2)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；3)将步骤1)得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。该专利技术易于实施、操作简便、结果明确，证明了用离体耳中动脉观察荧光标记的血管干细胞附壁是可行的。但是，该专利中需要避光循环灌流的时间为1～4h，耗时较长，该方法推广应用尚存在一定的局限性。
技术实现思路
鉴以此，本专利技术的目的是提供一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，主要对灌流步骤进行改进，有效解决现有技术中灌流时间过长的问题。本专利技术的技术方案是：一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：1)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3～5min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；2)将经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3～5min后，改用灌流助液循环灌流5～8min，再继续用含有经荧光染料标记的血管干细胞的罐流液循环灌流3～5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察；3)结果判断：损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，完整的中动脉未观察到荧光；其中，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。优选的，所述的血管干细胞为内皮前体细胞，内皮前体细胞粘附于损伤的中动脉的受损部位。优选的，所述灌流液为含有0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液。优选的，所述灌流助液为含有5mmol/L的氯化钾、5mmol/L的氯化镁、0.1mmol/L麦冬多糖和1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。优选的，灌流速度为2.0mL/min。优选的，加入灌流液中的经荧光染料标记的血管干细胞的量为1×103个细胞/mL灌流液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术在现有技术的基础上，对灌流液进行优化，并在灌流过程中采用了灌流助剂，采用本专利技术方法，灌流时间降至11min，相比于现有技术的1h，灌流时间明显降低，整体缩短利用中动脉观察血管干细胞的时间，提高工作效率，且操作简便，易于推广应用。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术实施例中所述任-洛液为：成分含量NaCl(g)9KCl(g)0.42CaCl2(g)0.24NaHCO2(g)0.5KH2PO4(g)0.5Glucose(g)1.0蒸馏水加至(ml)1000本专利技术实施例中所用中动脉为兔耳中动脉，兔耳中动脉指耳背部外2/3段耳中动脉(长度随兔品系及年龄为4～10cm)。实施例1一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法1、方法1)晚期发育的内皮前体细胞(OECs)体外扩增及鉴定：在戊巴比妥钠麻醉下，抽取兔的两股骨的骨髓共6mL，从中分离出超过2×108单个核细胞(MNCs)。将MNCs接种于胶原蛋白Ι包被的培养皿中用内皮细胞基础培养基(EBM-2)及添加剂(包括肝素、抗坏血酸、庆大霉素、两性霉素B、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子等，均为Clonetics公司产品)培养28天，获得4～5×107贴壁细胞。细胞呈鹅卵石状，可摄入低密度脂蛋白，能结合血凝素，CD144、caveolin-1表达阳性，CD14、CD45表达阴性，产生一氧化氮，具迁移能力，在基质Matrigel-Matrix存在时可形成管状结构；3)荧光染料标记：用CM-Dil标记OECs，细胞在贴壁状态下2μg/mLCM-DilPBS溶液37℃孵育5min，4℃下15min，PBS洗两遍；4)先用灌流液，在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3min，灌流液自兔耳中动脉流入，由兔耳静脉流出；5)离体兔耳灌流法观察自体OECs附壁：将经荧光染料标记的OECs加入灌流液中(1×103个细胞/mL灌流液)，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3min后，改用灌流助液循环灌流5min，再继续用前述含有经荧光染料标记的血OECs的罐流液循环灌流3min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。其中，所述灌流液为含有0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5mmol/L的氯化钾、5mmol/L的氯化镁、0.1mmol/L麦冬多糖和1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水，灌流速度为2.0mL/min。实验设2组：①耳中动脉内皮完整组②耳中动脉内皮受损组2、结果与分析实验表明，CM-Dil标记的自体OECs恒压灌流11min，荧光显微镜下，耳中动脉内皮受损段可看到极强的红色荧光，在其他部位未看到荧光，在内皮完整耳中动脉未看到荧光。实施例2一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法实施例2与实施例1的区别在于，4)先用灌流液，在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3min，灌流液自兔耳中动脉流入，由兔耳静脉流出；5)离体兔耳灌流法观察自体OECs附壁：将经荧光染料标记的OECs加入灌流液中(1×103个细胞/mL灌流液)，在恒温恒压条件下，避光循环灌流5min后，改用灌流助液循环灌流8min，再继续用前述含有经荧光染料标记的血OECs的罐流液循环灌流5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。其中，所述灌流液为含有0.1mmol/L麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有10mmol/L的氯化钾、8mmol/L的氯化镁、0.2mmol/L麦冬多糖和0.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。实验设2组：①耳中动脉内皮完整组②耳中动脉内皮受损组2、结果与分析实验表明，CM-Dil标记的自体OECs恒压灌流18min，荧光显微镜下，耳中动脉内皮受损段可看到极强的红色荧光，在其他部位未看到荧光，在内皮完整耳中动脉未看到荧光。对比例1采用专利ZL201310156400.7公开的“一种观察血管干细胞附壁的方法”。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3～5min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；2)将经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3～5min后，改用灌流助液循环灌流5～8min，再继续用含有经荧光染料标记的血管干细胞的罐流液循环灌流3～5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察；3)结果判断：损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，完整的中动脉未观察到荧光；其中，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任‑洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3～5min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；2)将经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3～5min后，改用灌流助液循环灌流5～8min，再继续用含有经荧光染料标记的血管干细胞的罐流液循环灌流3～5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察；3)结果判断：损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，完整的中动脉未观察到荧光；其中，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐国光，鲁南，马立新，
申请(专利权)人：上海拉德钫斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31