人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用制造技术

本发明专利技术涉及了人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用。将人子宫内膜间充质干细胞以PBS重悬制成干细胞制剂注射到造模大鼠的心肌损伤局部，心脏彩超观察心功能变化、PET‑CT观察心肌细胞活性及能量代谢、Masson染色观察纤维化程度，显示与人骨髓间充质干细胞比较，人子宫内膜间充质干细胞具有更好的改善心肌细胞活性、能量代谢、心肌纤维化等作用，最终达到修复损伤心肌的目的。本发明专利技术提供的人子宫内膜间充质干细胞制剂可以作为改善损伤心肌细胞活性和功能的药物应用于心血管系统疾病中。

Application of Human Endometrial Mesenchymal Stem Cells in Improving Injured Myocardial Cells

The invention relates to the application of human endometrial mesenchymal stem cells in improving injured myocardial cells. Human endometrial mesenchymal stem cells were re-suspended with PBS and injected into the myocardial injury area of model rats. The changes of cardiac function were observed by echocardiography, the activity and energy metabolism of cardiac myocytes were observed by PET CT, and the degree of fibrosis was observed by Masson staining. The results showed that compared with human bone marrow mesenchymal stem cells, human endometrial mesenchymal stem cells had a better effect on improving cardiac myocytes. Activation, energy metabolism, myocardial fibrosis and other functions ultimately achieve the purpose of repairing damaged myocardium. The human endometrial mesenchymal stem cell preparation provided by the invention can be used as a medicine to improve the activity and function of injured cardiac myocytes in cardiovascular diseases.

【技术实现步骤摘要】
人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用
本专利技术涉及一种间充质干细胞，特别是一种人体子宫内膜来源的间充质干细胞。本专利技术的人子宫内膜间充质干细胞能够改善损伤心肌细胞的活性和功能，从而可以更好地修复因心肌细胞功能障碍所致的心脏疾病。
技术介绍
随着经济的加速发展，人类生活方式和饮食结构不断发生变化，冠状动脉粥样硬化性心脏病呈持续增长趋势。其可以引起局部心肌细胞凋亡、心肌细胞纤维化、能量代谢障碍等，最终发生心力衰竭。而心力衰竭严重影响人们的生活质量，是造成人类死亡的重要原因。干细胞是一种具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，具有修复受损组织细胞的潜能，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的种子细胞，是各种疾病尤其是各种难治性疾病可能的新的有效治疗方法。再生医学不断发展，干细胞移植修复损伤心肌细胞已成为心血管系统疾病最有前景的治疗方法。其中，心肌功能的重塑是关键，包括心肌细胞活性的改善、心肌细胞能量代谢的改善、心肌纤维化的改善等。通过再生医学能够达到有效改善损伤心肌活性和功能的理想种子细胞，除了应具有增殖能力强，分化良好，免疫原性低，容易获取以及分泌能力强大等特点外，最主要的是应该具有强的成血管能力。201810930181.6专利申请涉及一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其从人子宫内膜组织中分离培养得到一种具有强修复再生能力的人子宫内膜间充质干细胞，并证明该间充质干细胞具有更强的增殖能力，即具有更强的活力，具备快速获得更多种子细胞的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用。专利技术人通过小鼠研究显示，结扎小鼠左冠状动脉后，小鼠的子宫细胞归巢到心肌损伤区参与心肌细胞修复并改善心功能，以及子宫源性的细胞能显著增加血管形成。因此，在人体子宫中存在具有强修复再生能力的干细胞。专利技术人已经从人体的子宫内膜组织中分离培养出人子宫内膜间充质干细胞。本专利技术进一步验证了这种人子宫内膜间充质干细胞具有更强的促血管形成能力，可以更好的改善损伤心肌细胞活性、改善损伤心肌能量代谢及纤维化程度。基于此，本专利技术将所培养得到的人子宫内膜间充质干细胞作为改善损伤心肌细胞的药物进行应用。具体地，本专利技术是将培养出的人子宫内膜间充质干细胞用PBS重悬后，混匀制成用于改善损伤心肌细胞的人子宫内膜间充质干细胞制剂。更具体地，本专利技术是采用培养出的P3～P6代人子宫内膜间充质干细胞制备所述人子宫内膜间充质干细胞制剂。本专利技术所制备的人子宫内膜间充质干细胞制剂中，优选每1ml干细胞制剂中含有(3～7)×107个人子宫内膜间充质干细胞。本专利技术从体外和在体两方面进行了上述人子宫内膜间充质干细胞制剂改善损伤心肌细胞活性和功能的验证研究。将添加有人子宫内膜间充质干细胞培养上清的脐静脉内皮细胞单细胞悬液接种于Matrigel基质胶上，通过体外实验证明了人子宫内膜间充质干细胞可以促进脐静脉内皮细胞在Matrigel上的小管形成。结扎裸大鼠冠状动脉左前降支进行造模，向造模成功裸大鼠的心肌损伤局部注射人子宫内膜间充质干细胞制剂，心脏彩超观察心功能变化、PET-CT观察心肌细胞活性及能量代谢、Masson染色观察纤维化程度，通过在体实验证明人子宫内膜间充质干细胞制剂可以通过更好的改善损伤心肌细胞活性、能量代谢及纤维化程度，起到更好的修复损伤心肌的作用。附图说明图1是人子宫内膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞体外促血管形成的形态图。图2是超声心动图评估各组造模前后裸大鼠的左室心功能变化结果。图3是PET-CT评估各组造模前后裸大鼠的心肌细胞活性和能量代谢效果。图4是Masson三色染色后显示各组裸大鼠治疗后损伤心肌区的纤维化变化情况。具体实施方式下述实施例仅为本专利技术的优选技术方案，并不用于对本专利技术进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。实施例1：制备人子宫内膜间充质干细胞制剂。将人子宫内膜间充质干细胞用含1%青链霉素的10%FBS-DMEM/F12培养基进行培养，将培养瓶放入37℃5%CO2的培养箱中，每3～4天更换培养基。待细胞融合达到80～90%时，0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)消化，以1∶3的比例传代，得到第1代人子宫内膜间充质干细胞，记为P1。重复上次操作，制备得到P3～P6代人子宫内膜间充质干细胞。选取生长状态良好的P3～P6代细胞，细胞融合达到80～90%时，用PBS缓冲液冲洗3遍，洗干净FBS后，加入0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)消化3～4min，显微镜下观察细胞变圆，加入10%FBS-DMEM/F12终止消化，吸入15ml离心管中离心，弃上清保留细胞团。将所得细胞团用PBS液清洗残留血清后，用PBS液以(3～7)×107/ml的浓度重悬，制备得到(3～7)×106/100µl的人子宫内膜间充质干细胞制剂。以上制备人子宫内膜间充质干细胞制剂的所有操作均在无菌操作台中操作，并且在制作、运输、使用中均执行无菌操作原则。实施例2：人子宫内膜间充质干细胞Matrigel基质胶体外促血管形成实验。以人子宫内膜间充质干细胞作为实验组，人骨髓间充质干细胞作为对照组。取人子宫内膜间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞，分别接种在12孔板上，以10%FBS-DMEM/F12或10%FBS-IMDM正常培养基培养，待细胞生长至70～80%融合时，更换为2%FBS-DMEM/F12。同时在空白板中加入2%FBS-DMEM/F12作为空白组。以上各组继续培养4天后，收集各组细胞培养上清，进行体外管状结构形成实验。实验前，将Matrigel基质胶置于4℃冰箱内过夜，融化为液体状态。加样的枪头、96孔板在-20℃冰箱过夜，保持低温。以预冷的枪头吸取100µlMatrigel，铺于预冷的96孔细胞培养板中，以上所有操作均在冰上进行。铺板完毕后，将96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2的培养箱内孵育45min以上，使之凝固。在凝胶等待中，0.05%胰酶消化人脐静脉内皮细胞，以上述收集的各组细胞培养上清制备人脐静脉内皮细胞悬液。细胞计数，将细胞悬液制备成3×105/ml，每孔以3×104个细胞接种于上述用Matrigel基质胶铺好的96孔细胞培养板上，置于37℃，5%CO2的培养箱内孵育。培养3h后，倒置显微镜下观察内皮细胞在Matrigel上的小管形成状态并拍照，结果见图1。图1中A为人子宫内膜间充质干细胞上清促脐静脉内皮细胞形成的管状结构；B为人骨髓间充质干细胞上清促脐静脉内皮细胞形成的管状结构；C为空白培养液促脐静脉内皮细胞形成的管状结构。图中管状结构数量越多，代表具有更强的促进脐静脉内皮细胞形成管状结构的旁分泌功能，成血管能力越强。Matrigel基质胶体外促血管形成实验证明，人子宫内膜间充质干细胞与同年龄段、相同代数的人骨髓间充质干细胞相比，具有更强的促脐静脉内皮细胞成血管能力。实施例3：人子宫内膜间充质干细胞修复损伤心肌的实验。结扎裸大鼠冠状动脉左前降支造模，1周后损伤心肌局部组织注射人子宫内膜间充质干细胞治疗心肌梗死。取200～250g裸大鼠，手术前电推备皮，3%本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人子宫内膜间充质干细胞制剂作为改善损伤心肌细胞的药物的应用。

【技术特征摘要】
1.人子宫内膜间充质干细胞制剂作为改善损伤心肌细胞的药物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，是将人子宫内膜间充质干细胞用PBS重悬，混匀制成用于改善损伤心肌细胞的人子宫内膜间充质干细胞制剂。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：解军，范雪梅，何生，杨丽红，宋慧芳，平毅，李仁科，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14