一种长效EPO活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种长效EPO活性检测方法。设置生理盐水组为空白组，短效EPO组为对照组，待测药物组，分别将生理盐水、短效EPO和待测药物对小鼠进行皮下注射，定期采集血液；然后用流式细胞仪检测血液中网织红细胞含量，并计算网织红细胞的百分率；和/或用细胞计数仪检测血液中血细胞的数量，计算血细胞中含有的网织红细胞的数量；通过网织红细胞含量和/或网织红细胞的数量来判定待测药物是否为长效EPO。本发明专利技术克服了上述缺陷，将待测药物注入小鼠体内，对血液中的网织红细胞含量和/或网织红细胞的数量进行判断，从而来判断待测药物是否为长效EPO的，其操作简单，准确。

A Long-acting Method for Detecting EPO Activity

The invention discloses a long-acting EPO activity detection method. The normal saline group was set as blank group, the short-acting EPO group as control group, and the drug group to be tested were injected subcutaneously with normal saline, short-acting EPO and the drug to be tested in mice, and blood was collected regularly; then the reticulocyte content in blood was detected by flow cytometry, and the percentage of reticulocyte was calculated; and/or the number of blood cells in blood was measured by cell counting instrument and calculated. The number of reticulocytes contained in blood cells; the content of reticulocytes and/or the number of reticulocytes were used to determine whether the drug was a long-acting EPO. The method overcomes the defects mentioned above, injects the drug to be tested into mice, judges the reticulocyte content and/or the number of reticulocytes in blood, and thus judges whether the drug to be tested is a long-acting EPO. The operation is simple and accurate.

【技术实现步骤摘要】
一种长效EPO活性检测方法
本专利技术属于药物活性检测领域，具体涉及一种长效EPO活性检测方法。
技术介绍
：促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是特异作用于红系祖细胞增殖、分化并成熟为红细胞的糖蛋白类造血生长因子，分子量30.4kD，由165个氨基酸组成，其中约占分子量40％的糖链在EPO生物合成、结构稳定、体内活性发挥很重要的作用。在全球范围内，有短效EPO和长效EPO之分。短效EPO的血清半衰期较短，临床给药次数为每周2-3次，给药频繁。长效EPO的血清半衰期可以达到两周，临床给药次数为一周到两周1次(取决于疾病和进程的不同)。我国已经获批的EPO产品均为短效，尚没有长效EPO的上市，而长效EPO在国外已经上市超过10年。我国长效EPO尚处于临床试验和临床前研究阶段。EPO生物学活性与其在体内的半衰期密切相关。EPO生物学活性测定方法分体外法和体内法。因为现今我国医药市场主要以短效EPO为主，现阶段体内生物学活性检测方法也主要针对短效EPO，而针对长效EPO的体内活性的检测方法暂鲜见，因此无法判断研发的EPO是否具有长效性。因此开发本方法用于检测判断EPO长短效性。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种长效EPO活性检测方法，该方法解决了现有技术中的空缺和存在的问题，且操作简单、准确。本专利技术的长效促红细胞生成素(EPO)活性检测方法，包括以下步骤：a、设置生理盐水组为空白组，短效EPO组为对照组，待测药物组，分别将生理盐水、短效EPO和待测药物对小鼠进行皮下注射，定期采集血液；b、然后用流式细胞仪检测血液中网织红细胞含量，并计算网织红细胞的百分率；和/或用细胞计数仪检测血液中血细胞的数量，计算血细胞中含有的网织红细胞的数量；通过网织红细胞含量和/或网织红细胞的数量来判定待测药物是否为长效EPO。优选，所述的定期采集血液是定期进行尾静脉取血。进一步优选，所述的定期进行尾静脉取血是每天进行尾静脉取血。EPO注射到小鼠体内后，短效EPO组在第5天网织红细胞含量(Ret％)恢复至正常小鼠水平；而长效EPO组，小鼠Ret％在注射后第7天仍比对照组高，则可判定待测药物为长效EPO。计算公式：Ret％＝(网织红细胞数量/红细胞数量)*100％。从第7天开始，由于前面几天EPO促进网织红细胞增多，最终成熟为红细胞(需要时间约为24-48小时)的绝对数量也增多。通过细胞计数仪对空白组、短效EPO和待测药物组的血细胞计数，计算小鼠血液中网织红细胞的绝对数量。网织红细胞的绝对数量的多少也可判定待测药物是否为长效EPO。计算公式：Ret数量＝红细胞数量*Ret％体外生物学活性检测方法难以准确判断EPO长效性，因EPO的长短效性与其自身的唾液酸水平密切相关，所以其活性应该通过血清代谢水平来判断其长短效性。本专利技术克服了上述缺陷，将待测药物注入小鼠体内，对血液中的网织红细胞含量和/或网织红细胞的数量进行判断，从而来判断待测药物是否为长效EPO的，其操作简单，准确。附图说明：图1是注射长效或短效EPO后网织红细胞占血细胞的比例Ret％(A为40IU剂量EPO，B为10IU剂量EPO)；图2是注射长效或短效EPO后网织红细胞数量(A为40IU剂量组，图B为10IU剂量组)。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：第一部分：1.SPF级别BalB/C小鼠(8-12周龄)雌雄各半，共20只，随机分为5个组，每组4只小鼠。同时设置为空白组(生理盐水组)、对照组2组(40IU和10IU短效EPO益比奥)和样品组(40IU和10IU长效EPO-日本麒麟公司生产的长效EPO，简称NESP)。2.按照40IU和10IU的剂量分别对小鼠进行皮下注射，空白组注射同体积生理盐水。3.24h后用断尾取尾静脉血的方法收集血液约50微升，每隔24h采集尾静脉血一次用于后续分析。第二部分：1.对采集到的尾静脉血液进行1000倍稀释，用噻唑橙对血细胞染色30min，然后用流式细胞仪检测网织红细胞比例。2.设置FSC＝230mV,SSC＝320mV,FITC通道＝400mV，对血细胞总的网织红细胞进行计数，自动计算出Ret％的比率。3.描绘day1至day11的Ret％数值变化图。第三部分：1.对采集到的尾静脉血液进行1000倍/1500倍稀释，用细胞计数仪对细胞数量进行计数。2.由于总血细胞中红细胞数量占绝大多数(超过99％比例)，可以近似认为所计数的血细胞为红细胞数量。3.得出的血细胞数量乘以Ret％得到该小鼠的网织红细胞数量。4.对EPO是否具有长效性的判断：比较注射EPO后小鼠体内网织红细胞数量的变化趋势既可以判断EPO的长短效活性。EOP活性长短效的判断标准：1、EPO注射到小鼠体内后，短效EPO组在第5天网织红细胞含量(Ret％)恢复至正常小鼠水平；而长效EPO组，小鼠Ret％在注射后第7天仍比对照组高，则可判定待检EPO为长效EPO。计算公式：Ret％＝(网织红细胞数量/红细胞数量)×100％如图1所示，从图1A结果40IU的EPO剂量组可以看出，短效EPO组从day5出现Ret％基本已经与生理盐水组持平；长效EPO组Ret％则到Day7开始与生理盐水组持平。在图1B结果可见10IU剂量Ret％恢复的时间均提前1-2天，表明剂量的高低直接影响EPO的活性。2.从第7天开始，由于前面几天EPO促进网织红细胞增多，最终成熟为红细胞(需要时间约为24-48小时)的绝对数量也增多。通过细胞计数仪对空白组、短效EPO和长效EPO组的血细胞计数，计算小鼠血液中网织红细胞的绝对数量。网织红细胞的绝对数量的多少也可判定待检EPO是否为长效EPO。计算公式：Ret数量＝红细胞数量×Ret％如图2所示，从图2A和2B可见，注射EPO后网织红细胞数量一直维持数量增加的趋势。在40IU剂量组，长效EPO和短效EPO相比，前者网织红细胞的数量显著增多，在顶峰时(day5)增多达2倍。在第7天后，两组区别EPO组与空白组比较已经无显著差异。在10IU剂量组，长效EPO刺激网织红细胞数量在第3-4天达到顶峰，显著比短效EPO的效果好。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长效促红细胞生成素活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a、设置生理盐水组为空白组，短效EPO组为对照组，待测药物组，分别将生理盐水、短效EPO和待测药物对小鼠进行皮下注射，定期采集血液；b、然后用流式细胞仪检测血液中网织红细胞含量，并计算网织红细胞的百分率；和/或用细胞计数仪检测血液中血细胞的数量，计算血细胞中含有的网织红细胞的数量；通过网织红细胞含量和/或网织红细胞的数量来判定待测药物是否为长效EPO。

【技术特征摘要】
1.一种长效促红细胞生成素活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a、设置生理盐水组为空白组，短效EPO组为对照组，待测药物组，分别将生理盐水、短效EPO和待测药物对小鼠进行皮下注射，定期采集血液；b、然后用流式细胞仪检测血液中网织红细胞含量，并计算网织红细胞的百分率；和/或用细胞计数仪检测血液中血细胞的数量，计算血细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王笑非，杨威，梁桂婵，叶才果，邓新宇，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，佛山安普泽生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44