白及高温内参基因Bs18S rRNA和BsUBI制造技术

本发明专利技术属于白及基因组技术领域，具体涉及两个在高温条件下稳定表达的高温内参基因Bs18S rRNA和BsUBI。所述Bs18S rRNA基因，含有1792bp；所述BsUBI基因，含有422bp。本申请中，基于正常生长温度和高温胁迫条件下的对比，对部分候选内参基因的表达稳定性进行了实时荧光定量PCR分析，综合分析结果表明：Bs18S rRNA和BsUBI这两个基因在正常生长温度和高温胁迫下的不同时间和不同组织中表达情况最为稳定，因此可为高温胁迫条件下基因表达稳定性和可靠性研究、以及耐高温白及种质资源筛选和培育奠定一定应用基础。

Bs18S rRNA and BsUBI of White and High Temperature Internal Reference Genes

The invention belongs to the technical field of white and white rice genome, and specifically relates to two high temperature internal reference genes Bs18S rRNA and BsUBI which are stably expressed at high temperature. The Bs18S rRNA gene contains 1792 BP and the BsUBI gene contains 422 bp. In this application, based on the comparison between normal growth temperature and high temperature stress, the expression stability of some candidate internal reference genes was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results of comprehensive analysis showed that Bs18S rRNA and BsUBI genes were most stable in different time and tissues under normal growth temperature and high temperature stress, so they could be used as high temperature stress conditions. The study on stability and reliability of gene expression and screening and breeding of high temperature tolerant white and white rice germplasm resources laid a certain application foundation.

【技术实现步骤摘要】
白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI
本专利技术属于白及基因组
，具体涉及两个在高温条件下稳定表达的高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI。
技术介绍
白及（Bletillastriata（Thunb.）Reihb.f.），又白芨、良姜、紫兰、连及草、白根、地螺丝、羊角七等，属兰科白及属多年生草本植物，是中药材白及的基原植物，以块茎入药，具有补肺、消肿、止血、生肌等功效。主要分布于我国华南、西南海拔100~3200m林下阴湿处或山坡草丛中。白及性喜温暖、阴凉和较阴湿的环境，高于36℃其生长便会受到明显影响。因此，耐热性资源和基因挖掘是白及育种工作的重要目标之一。内参基因原则上是在某个条件下恒定表达的基因，主要作为检测目的基因在特定条件下的表达水平情况的参照物。很多研究表明，不同物种不同条件下，内参基因的表达水平是变化的，在任何条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在。因此不同条件下选择合适的内参基因是实时荧光定量PCR研究的关键之一。因此，在研究某个物种某种特定条件下目的基因的表达情况时，应先筛选在这种条件下能够稳定表达的内参基因。而就白及基因研究而言，由于白及的不耐热特性，因此在进行耐热性资源筛选时，筛选确定高温条件下可稳定表达的内参基因，对于相关基因分析及遗传育种研究工作均具有十分重要的应用意义。
技术实现思路
本申请目的在于提供两个在正常生长温度及高温胁迫条件下在不同组织以及不同生长阶段均能稳定表达的内参基因Bs18SrRNA和BsUBI，从而为白及相关功能基因研究及耐高温白及资源筛选奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI，这两个基因在白及正常生长及高温胁迫条件下表达均较为稳定一致，所述Bs18SrRNA基因，含有1792bp，碱基序列如SEQIDNO.6所示；所述BsUBI基因，含有422bp，碱基序列如SEQIDNO.7所示。用于PCR扩增获得白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI的简并引物，具体如下：Bs18SrRNA-F：5’-TGGTTGATCCTGCCAGTAGT-3’，Bs18SrRNA-R：5’-GTTCACCTACGGAAACCTTG-3’，BsUBI-F：5’-ATGCAGATCTTCGTGAARACCCT-3’，BsUBI-R：5’-CAGTAGTGGCGRTCGAAGTGGT-3’。利用所述简并引物获得白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI的PCR扩增方法，包括如下步骤：（1）提取总RNA并反转录为cDNA作为扩增模板；（2）利用简并引物进行PCR扩增，PCR扩增时，20μL扩增体系参考设计如下：10×PCRBuffer，2.0μL；dNTP（2.5mmol/L），1.6μL；引物F和R（均为10mmol/L），各0.5μL；cDNA模板，0.8μL；rTaqDNA聚合酶（5U/μL），0.2μL；ddH2O，14.4μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸80s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。所述白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI在白及中的应用，作为内参基因应用，具体例如用于功能性基因核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因（rbcL）的荧光定量检测分析。一种荧光定量检测核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因的检测方法，检测是以Bs18SrRNA和/或BsUBI作为内参基因，具体包括如下步骤：（1）设计荧光定量引物如下Bs18SrRNA-F：5’-TTTATGAAAGACGAACCACTGC-3’，Bs18SrRNA-R：5’-TCGGCATCGTTTATGGTTG-3’；BsUBI-F：5’-CGCCGATTACAACATCCAGAA-3’，BsUBI-R：5’-TTCTTGGGCTTGGTGTATGTC-3’；qBsrbcl-F：5’-CCAAAACTTTCCAAGGTCCG-3’，qBsrbcl-R：5’-TCCACCCCGTAGACATTCATA-3’；（2）提取总RNA并反转录为cDNA作为扩增模板，荧光定量PCR检测时，20.0μL反应体系设计为：2×SYBRPremixExTaqⅡ，10.0μL；引物F和R，各0.8μL；cDNA模板，2.0μL；ddH2O，6.4μL；反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s，进行40个循环。现有技术中，针对白及基因组，虽然有部分功能性基因的研究，但是尚未见到针对3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、18S核糖体RNA基因（18SrRNA）、转录延伸因子1A基因（EF1α）、α微管蛋白基因（TUA）、β微管蛋白基因（TUB）、泛素延伸蛋白基因（UBI）、NAC域蛋白基因（NAC）这7个基因的详细研究。本申请中，基于正常生长温度和高温胁迫条件下的对比，对这7个候选内参基因的表达稳定性进行了实时荧光定量PCR分析，综合分析结果表明：Bs18SrRNA和BsUBI这两个基因在正常生长温度和高温胁迫下的不同时间和不同组织中表达情况最为稳定，因此可为高温胁迫条件下基因表达稳定性和可靠性研究、以及耐高温白及种质资源筛选和培育奠定一定应用基础。附图说明图1为所提取白及总RNA电泳图；图2为以Bs18SrRNA为内参rbcL基因相对表达量；图3为以BsUBI为内参rbcL基因相对表达量。具体实施方式下面结合实施例对本申请技术方案做进一步的解释说明，在具体介绍前，首先就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等背景情况简要介绍说明如下。生物材料：白及，一种常见药用、观赏兰科植物，下述实施例中所用实验材料取自郑州师范学院兰花工程研究中心智能日光温室内；相关引物序列合成及测序工作由上海英俊生物技术公司提供完成；实验试剂：氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受态细胞、pGEM-Teasy载体、PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒、SYBR®PremixExTaqTM、RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit等，购自TaKaRA公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、Omega6837-01植物总RNA提取试剂盒等，购自天根试剂公司；实验设备：微量分光光度计（RNA浓度测定用），美国QuawellQ5000；荧光定量PCR仪Mastercyclereprealplex2，德国Eppendorf公司产品；基因扩增PCR仪T3000Thermocycler，德国Biometra公司产品；植物人工气候箱，美国PERCIVALE-41HO2。实施例1综合专利技术人前期已有工作，专利技术人认为，通过高温胁迫处理白及进而筛选可得在正常生长温度条件下及高温胁迫条件下的内参基因，基于这一设想，专利技术人进行了实际筛选验证工作，本实施例就相关筛选工作过程及相关筛选结果简要介绍如下。（一）高温胁迫处理及cDNA模板制备本申请中，所述高温胁迫预处理，具体方式为：在温室大棚内选取同生长期的两年生白及苗，于植物人工气候箱中预培养7d（培养条件：光暗比12h/12h，温度26℃，相对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.白及高温内参基因Bs18S rRNA和BsUBI，其特征在于，所述Bs18S rRNA基因，含有1792bp，碱基序列如SEQ ID NO.6所示；所述BsUBI基因，含有422bp，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI，其特征在于，所述Bs18SrRNA基因，含有1792bp，碱基序列如SEQIDNO.6所示；所述BsUBI基因，含有422bp，碱基序列如SEQIDNO.7所示。2.用于PCR扩增获得白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI的简并引物，其特征在于，具体引物设计如下：Bs18SrRNA-F：5’-TGGTTGATCCTGCCAGTAGT-3’，Bs18SrRNA-R：5’-GTTCACCTACGGAAACCTTG-3’，BsUBI-F：5’-ATGCAGATCTTCGTGAARACCCT-3’，BsUBI-R：5’-CAGTAGTGGCGRTCGAAGTGGT-3’。3.利用权利要求2所述简并引物获得白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI的PCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取总RNA并反转录为cDNA作为扩增模板；（2）利用简并引物进行PCR扩增。4.白及高温内参基因Bs18SrRNA和BsUBI在白及中的应用，其特征在于，作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁芳，牛苏燕，许申平，张燕，李玉华，蒋素华，袁秀云，马杰，崔波，王墨霏，
申请(专利权)人：郑州师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41