一种巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD定量方法技术

本发明专利技术公开一种千金子中巨大戟醇的HPLC‑DAD‑ELSD含量测定方法，步骤为：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）检测，取2）中巨大戟醇对照品溶液进行检测，检测条件为C18柱，以乙腈‑水为流动相进行等度洗脱，采用DAD和ELSD检测器进行HPLC‑DAD‑ELSD检测，分别绘制曲线得到标准曲线方程；取1）中供试品溶液，在上述条件下采用DAD和ELSD检测器进行HPLC‑DAD‑ELSD检测，将所得巨大戟醇的峰面积带入标准曲线线性回归方程中，将计算结果取平均值，即可得出千金子中巨大戟醇的含量。该方法的专属性、耐用性、精密度、准确度良好，适用于中药千金子的整体质量控制。

A Quantitative Method of Euphorbia macrophylla L. by HPLC-DAD-ELSD

The invention discloses an HPLC DAD ELSD content determination method for giant phosphatidylchol in Semen Euphorbiae. The steps are as follows: 1) preparation of test solution; 2) preparation of reference solution; 3) detection, taking 2) determination of giant phosphatidylchol reference solution in Semen Euphorbiae. The detection condition is C18 column, with acetonitrile water as mobile phase for isometric elution, and using DAD and ELSD detectors for HPLC DAD ELSD detection. The standard curve equation was obtained by plotting the curve separately. 1) Under the above conditions, the sample solution was detected by DAD and ELSD detectors. The peak area of the obtained enormous Euphorbia alcohol was brought into the linear regression equation of the standard curve, and the average value of the calculated results was taken to obtain the content of enormous Euphorbia alcohol in thousand gold seeds. The method has good specificity, durability, precision and accuracy, and is suitable for the overall quality control of Chinese traditional medicine Qianjin.

【技术实现步骤摘要】
一种巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD定量方法
本专利技术涉及一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法，属于中药分析领域。二、技术背景：1968年巨大戟醇（Ingenol）首次从大戟科植物E.ingens中分离得到，具有独特高张力5/7/7/3四环母核，通过与蛋白激酶C相互作用，产生抗癌、抗艾滋病度等药理活性。2012年，由LEO制药公司研发的巨大戟醇甲基丁烯酸酯凝胶（Ingenolmebutate，药品名Picato）获美国FDA批准上，成为首个用于治疗日光性角化病（actinickeratosis）的凝胶制剂。此外巨大戟醇甲基丁烯酸酯还可用于基底细胞癌治疗，正在进行Ⅱ期临床试验。生产上巨大戟醇甲基丁烯酸酯是以巨大戟醇为原料半合成得到，得率为62%。然而，巨大戟醇仅在续随子（Euphorbialathryis）等少数大戟属植物中分布。2013年LEO制药公司联合美国斯克里普斯研究所（TheScrippsResearchInstitute）PhilS.Baran研究团队开发了巨大戟醇14步全合成方法，但得率仅为1%左右，并需依赖手性催化剂，全合成成本高昂，难以产业化生产。目前，巨大戟醇的单体主要从天然植物中进行获取。因此，建立一种千金子中巨大戟醇含量测定的方法，可适用于指导千金子的临床用药以及整体质量控制。目前巨大戟醇的检测主要采用高效液相色谱法结合蒸发光散射检测器对巨大戟醇进行定性和定量分析。在低浓度范围内，由于ELSD检测器灵敏度小于紫外及检测器。另外，ELSD数据处理复杂，处理过程中可能会出现误差，导致定量测定结果不准确，且单一检测器的方法不能保证数据的准确性。因此开发高效、简便、准确、可靠的巨大戟醇含量测定方法具有重要意义。三、
技术实现思路
：为了解决上述问题，本专利技术目的是提供一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法，该方法利用HPLC-DAD-ELSD法同时对千金子中巨大戟醇的含量进行测定，对千金子的整体质量进行更好的控制，并对千金子的临床用药以及后续的新药研发奠定基础。本专利技术采用的技术方案为：一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法包括如下步骤1）供试品溶液的制备，称取供试品粉末2g，置于索氏提取器中，加丙酮溶液80mL，加热回流6~8小时，至脂肪油提尽，收集提取液，滤液回收溶剂得到丙酮提取物，所得丙酮提取物溶于20mL环己烷，并用乙腈（4×20mL）萃取，合并乙腈萃取液，再用80mL石油醚反洗2次得到乙腈萃取液。所得乙腈萃取液浓缩至干，溶于5mL甲醇，加入5%氢氧化钠调pH至12，室温搅拌过夜，稀盐酸调至中性并浓缩至无醇味。按体积比（1:1）加入乙酸乙酯萃取3次，合并浓缩乙酸乙酯层，加入甲醇转移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液做药材供试品溶液。2）对照品溶液的制备：精密称取巨大戟醇对照品1mg于容量瓶中，加入1mLHPLC级甲醇，溶解、摇匀、定容至刻度，得到1mg/mL的巨大戟醇标准品溶液3）检测，取2）中的巨大戟醇对照溶液进行检测，检测条件为C18柱，以乙腈-水为流动相进行等度洗脱，采用ELSD检测器进行HPLC-DAD-ELSD检测，分别计算同一保留时间下的峰面积，以巨大戟醇浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，得到巨大戟醇210nm下的标准曲线方程；以巨大戟醇浓度的对数，即lgC为横坐标，以峰面积对数lgA为纵坐标绘制标准曲线，得到巨大戟醇ELSD的标准曲线方程。取1）中供试品溶液在高效液相色谱检测条件为C18柱，以乙腈-水为流动相进行等度洗脱，采用DAD和ELSD检测器进行HPLC-DAD-ELSD检测，将所得巨大戟醇的峰面积带入标准曲线线性回归方程中，将计算结果取平均值，即可得出千金子中巨大戟醇的含量。所述的一种巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法，所述步骤3）中乙腈和水均需要用0.45um微孔滤膜过滤，并在超声仪中超声30min。如权利要求1所述的一种巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法，其特征在于所述步骤3）中乙腈和水均用0.45μm微孔滤膜过滤，在超声仪中超声30min如权利要求1所述的一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法其特征在于，所述步骤3）中乙腈和水的体积比为30:70。如权利要求1所述的一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法其特征在于，所述步骤3）中C18柱的规格为250mm×4.6mm×5μm，柱温30℃。如权利要求1所述的一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法其特征在于，所述步骤3）中C18柱，乙腈和水的流速为1mL/min进样量10ul。如权利要求1所述的一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法其特征在于，所述步骤3）中ELSD漂移管的温度为110℃，载气为空气，载气压力为0.5MPa，气流量是3L/min。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的方法看可用于巨大戟醇的含量测定，专属性、耐用性、精密度、准确度良好，适用于中药千金子的整体质量控制。ELSD作为一种通用型检测器，其影响值不依赖于光学性质，它对几乎所有的物质产生响应，采用ELSD可以针对中药材中那些没有紫外吸收或末端吸收的目标成分建立科学准确的质量控制方法，但ELSD数据处理相对麻烦，数据处理过程中容易产生误差，DAD也作为一种通用型检测器，在低浓度条件下，灵敏度高于ELSD，且遵循郎伯比尔定律，计算简单、方便、准确。本专利技术提供了一种利用HPLC-DAD-ELSD法测定巨大戟醇含量的测定方法，可以对中药千金子的质量进行更好的控制。本专利技术选择了乙腈-水作为流动相并选择更加方便的等度洗脱，可快速有效地将巨大戟醇和其他物质分离开，避免梯度洗脱时造成出现的洗脱时间长、峰重合等不利于定量的问题。不同的色谱柱有不同的分离效果，本专利技术使用乙腈:水=30:70的配比，采用PhenomenexC18柱250mm×4.6mm×5um，柱温30℃，使得巨大戟醇和其他化合物得到一个很好的分离效果。五、附图说明：图1为化合物巨大戟醇单体结构式，图1为摘要附图。图2为本专利技术实例中巨大戟醇标准品210nm和ELSD高效液相色谱图图3为本专利技术实例中千金子供试品210nm和ELSD的高效液相色谱图六、具体实施方式：结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。实施例1、一种千金子中巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD含量测定方法具体包括如下步骤一、供试品溶液的制备称取供试品粉末2g，置于索氏提取器中，加丙酮溶液80mL，加热回流6~8小时，至脂肪油提尽，收集提取液，滤液回收溶剂得到丙酮提取物，所得丙酮提取物溶于20mL环己烷，并用乙腈（4×20mL）萃取，合并乙腈萃取液，再用80mL石油醚反洗2次得到乙腈萃取液。所得乙腈萃取液浓缩至干，溶于5mL甲醇，加入5%氢氧化钠调pH至12，室温搅拌过夜。稀盐酸调至中性并浓缩至无醇味。按体积比（1:1）加入乙酸乙酯萃取3次，合并浓缩乙酸乙酯层，加入甲醇转移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巨大戟醇的HPLC‑DAD‑ELSD定量方法，其特征在于包括以下步骤：1）供试品的制备称取供试品粉末2g，置于索氏提取器中，加丙酮溶液80 mL，加热回流6~8小时，至脂肪油提尽，收集提取液，滤液回收溶剂得到丙酮提取物，所得丙酮提取物溶于20 mL环己烷，并用乙腈（4×20 mL）萃取，合并乙腈萃取液，再用80 mL石油醚反洗2次得到乙腈萃取液，得乙腈萃取液浓缩至干，溶于5 mL甲醇，加入5%氢氧化钠调pH至12，室温搅拌过夜，稀盐酸调至中性并浓缩至无醇味，按体积比（1:1）加入乙酸乙酯萃取3次，合并浓缩乙酸乙酯层，加入甲醇转移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液做药材供试品溶液，2） 对照品溶液的制备，精密称取巨大戟醇标准品1 mg于1 mL容量瓶中，用HPLC级甲醇溶解，定容，摇匀，得到巨大戟醇对照品溶液1 mg/mL，3） 检测，分别取2）中巨大戟醇对照品溶液进行检测，检测条件为C18柱，以乙腈‑水为流动相进行等度洗脱，采用DAD和ELSD检测器进行HPLC‑DAD‑ELSD检测，分别计算同一保留时间下的峰面积，以巨大戟醇含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到巨大戟醇210nm下的标准曲线方程；以巨大戟醇浓度的对数，即lgC为横坐标，以峰面积对数lgA为纵坐标绘制标准曲线，得到巨大戟醇ELSD的标准曲线方程，取1）中供试品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件为C18柱，以乙腈‑水溶液为流动相进行等度洗脱，采用DAD和ELSD检测器进行HPLC‑DAD‑ELSD检测，将所得巨大戟醇的峰面积带入两个标准曲线线性回归方程中，计算浓度结果，将计算结果取平均值，得出巨大戟醇的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种巨大戟醇的HPLC-DAD-ELSD定量方法，其特征在于包括以下步骤：1）供试品的制备称取供试品粉末2g，置于索氏提取器中，加丙酮溶液80mL，加热回流6~8小时，至脂肪油提尽，收集提取液，滤液回收溶剂得到丙酮提取物，所得丙酮提取物溶于20mL环己烷，并用乙腈（4×20mL）萃取，合并乙腈萃取液，再用80mL石油醚反洗2次得到乙腈萃取液，得乙腈萃取液浓缩至干，溶于5mL甲醇，加入5%氢氧化钠调pH至12，室温搅拌过夜，稀盐酸调至中性并浓缩至无醇味，按体积比（1:1）加入乙酸乙酯萃取3次，合并浓缩乙酸乙酯层，加入甲醇转移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液做药材供试品溶液，2）对照品溶液的制备，精密称取巨大戟醇标准品1mg于1mL容量瓶中，用HPLC级甲醇溶解，定容，摇匀，得到巨大戟醇对照品溶液1mg/mL，3）检测，分别取2）中巨大戟醇对照品溶液进行检测，检测条件为C18柱，以乙腈-水为流动相进行等度洗脱，采用DAD和ELSD检测器进行HPLC-DAD-ELSD检测，分别计算同一保留时间下的峰面积，以巨大戟醇含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到巨大戟醇210nm下的标准曲线方程；以巨大戟醇浓度的对数，即lgC为横坐标，以峰面积对数lgA为纵坐标绘制标准曲线，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜杉，陈雨，刘飞，赵兴增，吕慧，王鸣，冯煦，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32