佛甲草耐盐基因SLBHLH及其应用制造技术

本发明专利技术公开了佛甲草耐盐基因SLBHLH及其应用，佛甲草耐盐基因SLBHLH，是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，实验证明，佛甲草耐盐基因SLBHLH增强拟南芥或杨树耐盐性能。

【技术实现步骤摘要】
佛甲草耐盐基因SLBHLH及其应用
本专利技术涉及一种佛甲草(SedumlineareThunb,简称SlT)耐盐基因及其应用，属于分子生物学和生物

技术介绍
土壤的盐碱胁迫是降低农作物产量的主要环境因素之一。因此，研究和培育耐盐碱植物，对综合开发利用盐渍土壤、提高农作物产量意义重大。目前，世界上有4亿-9亿hm2的土地受盐渍化的影响，我国就有2600万hm2，其中耕地约600万hm2，土地盐渍化已成为影响作物生长发育及高产优质的一个重要因素。随着工业的不断发展，世界范围内可耕地数量日益减少，同时土地盐渍化不断加剧，因此，研究和培育耐盐碱植物，对综合开发利用盐渍土壤意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种佛甲草耐盐基因SLBHLH。本专利技术的第二个目的是提供含有佛甲草耐盐基因SLBHLH的克隆载体。本专利技术的第三个目的是提供含有上述克隆载体的宿主细胞。本专利技术的第四个目的是提供含有佛甲草耐盐基因SLBHLH的表达载体。本专利技术的第五个目的是提供含有上述表达载体的宿主细胞。本专利技术的第六个目的是提供佛甲草耐盐基因SLBHLH增强拟南芥或杨树耐盐性能的用途。本专利技术的技术方案概述如下：佛甲草耐盐基因SLBHLH，是序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。含佛甲草耐盐基因SLBHLH的克隆载体pJET1.2_SLBHLH。含有克隆载体pJET1.2_SLBHLH的宿主细胞。含佛甲草耐盐基因SLBHLH的表达载体pBI121_SLBHLH。含有表达载体pBI121_SLBHLH的宿主细胞。佛甲草耐盐基因SLBHLH增强拟南芥或杨树耐盐性能的用途。本专利技术的优点：实验证明，佛甲草耐盐基因SLBHLH增强拟南芥或杨树耐盐性能。附图说明图1为SLBHLH基因克隆电泳示意图。图2为SLBHLH插入表达载体后示意图。图3为pBI121_SLBHLH转化拟南芥后，转化子基因组PCR筛选结果。图4为pBI121_SLBHLH转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果。图5为SLBHLH转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果照片。图6为pBI121_SLBHLH转化杨树后，转化子基因组PCR筛选结果。图7为pBI121_SLBHLH转化杨树后，半定量PCR测定表达水平结果。图8为SLBHLH转基因杨树抗盐实验效果照片。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。载体pJET1.2:Thermo,CloneJETPCRCloningKit#K1231载体pBIl21购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/实施例11.佛甲草(SedumlineareThunb,简称SlT)SLBHLH基因的克隆从150mMNaCl水溶液处理的佛甲草(取自天津市滨海新区)中，使用植物RNeasyPlantMiniKit(TransgeneCode#E101-0150rxns)提取总RNA，并且利用EasyScriptFrist-StrandcDNASynSgesisSuperMix(TransgeneCode#AE301-03100rxns)反转录出cDNA。对cDNA进行高通量测序(诺禾致源公司进行高通量测序)获得SLBHLH基因的3’端序列，使用RACE技术(Takara-RACEkit)获得SLBHLH基因的全长cDNA序列将扩增得到的SLBHLH基因进行测序分析，得到完整的SLBHLH基因全长为1011bp。构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加pBI121重组位点，上游5'–ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3'(SEQIDNo.3)，下游5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3'(SEQIDNo.4)，以利于后期表达载体的构建。其具体步骤如下：1).cDNA第一链的合成用反转录试剂盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0，以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下：反应条件：42℃60min，99℃5min。2).佛甲草SLBHLH基因反转录质量PCR扩增检测用佛甲草Actin基因特异引物SEQIDNo.5:5'-GAACTTACTAGCCGACTG-3',SEQIDNo.6：5'-CCTCAAGCCTTATACGCAA-3'，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。PCR反应体系如下：反应条件：94℃3min；94℃30s，40℃30s，72℃50s，35cycles；72℃5min。3).佛甲草SLBHLH基因片段PCR扩增利用TakaraRACEkit扩增得到的SLBHLH基因进行测序分析，得到完整的佛甲草SLBHLH基因全长为1011bp(SEQIDNo.1)。由佛甲草SLBHLH基因编码的蛋白质，是SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。根据已知cDNA序列利用primer软件设计SLBHLH基因上下游引物:SEQIDNo.7:5'-ATGGCAATGGAAGCACTTCC-3'，SEQIDNo.8:5'-TTAGGTACATACATCACACATGG-3'，其PCR反应体系如下：PCR反应条件为:95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，90s，35cycles；72℃，10min；4℃，∞。PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。4).构建含有佛甲草SLBHLH基因的克隆载体构建含有佛甲草SLBHLH基因的载体pJET1.2_SLBHLH胶回收纯化后的佛甲草SLBHLH基因目的片段利用CloneJETPCRCloningKit(pJET1.2:Thermo,CloneJETPCRCloningKit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_SLBHLH。其反应程序如下：反应条件24℃,10min冰上静止30min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞DH5α，37℃，180rpm，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加抗生素Amp100uM)固体培养基中，37℃过夜培养。分别利用目的片段的上下游引物(SEQIDNo.7和SEQIDNo.8)对不同的菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性菌落测序，得到含有克隆载体pJET1.2_SLBHLH的宿主细胞。注：pJET1.2:Thermo,CloneJETPCRCloningKit#K1231载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为DH5α感受态细胞，TIANGEN，CB101-2。5).构建含有佛甲草SLBHLH基因的表达载体构建含有佛甲草SLBHLH基因的表达载体pBI121_SLBHLH构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端和3’添加pBI121重组位点，SEQIDNo.3:5'–ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3',SEQIDNo.4:5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3'得到：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.佛甲草耐盐基因SLBHLH，其特征是序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.佛甲草耐盐基因SLBHLH，其特征是序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.含权利要求1的一种佛甲草耐盐基因SLBHLH的克隆载体pJET1.2_SLBHLH。3.含有克隆载体pJET1.2_SLBHL...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洁华，王彩丽，杨晓沛，杨少辉，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12