一种重组人脑利钠肽包涵体高效率复性方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，它包括如下步骤：(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可。本发明专利技术还提供了一种重组人脑利钠肽的制备方法。本发明专利技术提供的复性方法，可以有效提高重组人脑利钠肽复性效率，操作简单、成本低，应用前景良好。

A High Efficiency Refolding Method for Recombinant Human Brain Natriuretic Peptide Inclusion Body

The invention provides a refolding method for recombinant human brain natriuretic peptide inclusion body protein, which comprises the following steps: (1) washing inclusion bodies: taking prokaryotic expression inclusion bodies of recombinant human brain natriuretic peptide and washing them with buffer solution containing 2 mol/L urea; (2) dissolving inclusion bodies: adding dissolving buffer solution, stirring for 4 hours, centrifuging, and obtaining supernatant; (3) adding refolding buffer in the supernatant obtained in step (2) adding refolding buffer in the supernatant. The supernatant can be obtained by refolding at 4 C and centrifugation. The invention also provides a preparation method of recombinant human brain natriuretic peptide. The refolding method provided by the invention can effectively improve the refolding efficiency of recombinant human brain natriuretic peptide, has simple operation, low cost and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人脑利钠肽包涵体高效率复性方法
本专利技术属于蛋白纯化
，具体涉及一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白的高效率复性方法。
技术介绍
脑利钠肽(BrainNatriureticPeptide，BNP)，又名脑钠素，是日本学者Sodoh等在1988年首次发现的一种利钠尿肽家族激素，主要由心脏分泌，具有利钠、利尿、舒张血管和降低血压等生理功能，在维持细胞渗透压、机体水盐代谢平衡和血压稳定等方面发挥重要作用，具有良好的药用开发价值。由于天然来源受到极大限制及内源性含量低，采用基因工程技术几乎成为了开发BNP的唯一的有效手段。目前已有重组人脑利钠肽(rhBNP)药物上市，分别为Nesiritide和新活素，用于治疗心力衰竭等病症。大肠杆菌系统表达重组蛋白具有易于操作、遗传背景清楚和表达水平高等特点，但是专利技术人在新活素研发过程中发现，使用大肠杆菌表达rhBNP时，表达产物为不溶解、无活性的固体颗粒，即包涵体，需要对包涵体进行复性才能获得有活性的可溶蛋白。包涵体复性作为一个复杂的过程，其成功与否很大程度上与蛋白本身的性质有关，而rhBNP复性效率极低，不到10％，导致生产高成本。因此，开发有效的rhBNP包涵体复性方法，对大规模原核表达rhBNP是极其必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对重组人脑利钠肽包涵体蛋白的高效率复性方法。本专利技术提供了一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，它包括如下步骤：(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；其中，所述溶解缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0；(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可；其中，所述复性缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L-精氨酸0.3～1mol/L，还原型谷胱甘肽1.5～2.5mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.1～0.5mmol/L，pH8.0。L-精氨酸：缩写L-Arg；还原型谷胱甘肽：缩写GSH；氧化型谷胱甘肽：缩写GSSG。本专利技术所述的各种溶液，溶剂均为水。本专利技术溶液中的各种组分浓度均为终浓度，例如“含2mol/L尿素的缓冲液”，即尿素终浓度为2mol/L。其中，步骤(1)中，在包涵体洗涤前，先加入溶液重悬、离心；所述重悬溶液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，pH8.0。其中，步骤(1)中，所述缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，2mol/L尿素，pH8.0；所述洗涤的方法为：加入缓冲液后重悬、离心取沉淀，即得。其中，步骤(2)中，溶解缓冲液的加入量为：每克包涵体湿重对应溶解缓冲液5ml。其中，步骤(3)中，所述复性缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L-精氨酸0.5mol/L，还原型谷胱甘肽2mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.2mmol/L，pH8.0；或，Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L-精氨酸1mol/L，还原型谷胱甘肽2mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.2mmol/L，pH8.0。其中，步骤(3)中，复性缓冲液的加入量为上清液的3倍体积；和/或，复性缓冲液为搅拌加入，加入速度为0.4～0.6倍体积上清液/小时。其中，步骤(3)中，加入速度为0.5倍体积上清液/小时。其中，步骤(3)中，4℃复性的时间为24h；离心的方法为：8000rpm、4℃离心30分钟。本专利技术还提供了上述方法获得的重组人脑利钠肽蛋白产物。本专利技术还提供了一种重组人脑利钠肽的制备方法，按照上述方法对重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性后，纯化，即可。利用本专利技术提供的特定复性方法和特定溶解、复性提取液，可将重组人脑利钠肽复性效率提高2.5倍以上，有效促进复性，本专利技术方法操作简单、成本低，为重组人脑利钠肽的大规模工业化生产提供基础，应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。本专利技术具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。实施例1本专利技术的重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法1、洗涤包涵体沉淀取包涵体形式的rhBNP，使用缓冲液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，pH＝8)重悬后，经冷冻大容量离心机离心5分钟重新获得，以便除去菌体培养基残留物。然后将包涵体沉淀用含2mol/L尿素的缓冲液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，2mol/L尿素，pH＝8)洗涤。2、溶解包涵体沉淀中试条件下，将洗涤过的包涵体沉淀按1g(湿重)：5mL的比例加BufferC缓冲液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，8mol/L尿素，pH＝8)搅匀，并在37℃下搅拌溶解4小时，以确保能最大限度溶解包涵体沉淀。为除掉更多的杂蛋白和未复性的融合蛋白，包涵体溶解后，8000rpm、温度4℃离心30分钟，留上清弃沉淀。3、包涵体蛋白的复性室温条件下，用蠕动泵缓慢加入复性缓冲液(50mmol/LTris-HCl+150mmol/LNaCl+0.5mol/LL-Arg+2mmol/LGSH+0.2mmol/LGSSG，pH＝8)至离心后的上清中，速度控制在0.5倍体积溶解液/小时，并不断用磁力搅拌器搅拌以防止局部过稀，缓冲液稀释至尿素为低浓度2mol/L，4℃放置24h。然后经8000rpm、4℃离心30分钟后，留上清，即可。实施例2本专利技术的重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法1、制备重组人脑利钠肽包涵体(1)构建重组表达菌根据GenBank中检索到的人BNP成熟蛋白序列，委托上海生工公司合成编码BNP蛋白的DNA序列，并分别在5’端和3’设计EcoRI和Sall酶切位点，经聚合酶链反应(PCR)，将合成的hBNP片段导入表达质粒PET32，然后转入BL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌BE01。(2)重组表达菌BE01发酵培养采用BHD基础培养发酵，当发酵体积为20升时，溶氧率(DO)控制在30％以上，pH控制在7.0，37℃培养；当OD600达到12时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM诱导，同时适当流加补料液。4小时后停止发酵培养，收获细菌。在上述条件下，我们连续进行三批次发酵。结果表明：该发酵工艺稳定可靠，且重现性较好。见表1。表1HXB01连续三批中试发酵结果(3)获得rhBNP包涵体发酵培养所得的发酵液，经冷冻高速离心机离心(5000rpm、5min)，收集菌体并用缓冲液(50mmol/LTri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；其中，所述溶解缓冲液包括如下配比的组分：Tris‑HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0；(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可；其中，所述复性缓冲液包括如下配比的组分：Tris‑HCl 50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L‑精氨酸0.3～1mol/L，还原型谷胱甘肽1.5～2.5mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.1～0.5mmol/L，pH8.0。

【技术特征摘要】
1.一种重组人脑利钠肽包涵体蛋白复性方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)洗涤包涵体：取重组人脑利钠肽的原核表达包涵体，加入含2mol/L尿素的缓冲液洗涤；(2)溶解包涵体：加入溶解缓冲液，搅拌4小时，离心，得上清液；其中，所述溶解缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，8mol/L尿素，pH8.0；(3)在步骤(2)所得上清液中加入复性缓冲液，4℃下复性，离心，获得上清液，即可；其中，所述复性缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，L-精氨酸0.3～1mol/L，还原型谷胱甘肽1.5～2.5mmol/L，氧化型谷胱甘肽0.1～0.5mmol/L，pH8.0。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，在包涵体洗涤前，先加入溶液重悬、离心；所述重悬溶液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，pH8.0。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述缓冲液包括如下配比的组分：Tris-HCl50mmol/L，氯化钠150mmol/L，2mol/L尿素，pH8.0；所述洗涤的方法为：加入缓冲液后重悬、离心取沉淀，即得。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：任东升，刘银花，张艳，何晨，
申请(专利权)人：西藏诺迪康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏,54