核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用技术

本发明专利技术涉及核桃蛋白质技术领域，具体涉及核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。本发明专利技术提供的小分子蛋白提取方法是利用葡聚糖凝胶层析原理将核桃仁皮蛋白按照分子量大小进行初步分离，选取分子量最小的蛋白组分进行活性研究。通过抑菌试验和细胞增殖试验发现核桃仁皮的小分子蛋白具有抑菌和抗癌的作用，所述小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌的抑制活性最好，MIC(最小抑菌浓度)值分别为14.5、7.5μg/mL；在作用浓度为120μg/mL时，Huh7(人肝癌细胞)的存活率为50％、SGC(人胃腺癌细胞)的存活率仅为10％。本发明专利技术提供的核桃仁皮小分子蛋白可以应用于抗菌药物和抗癌药物中。

Extraction and Application of Small Molecular Protein from Walnut Kernel

The invention relates to the technical field of walnut protein, in particular to a method for extracting small molecule protein from walnut kernels and its application. The invention provides a method for extracting small molecular proteins, which is based on the principle of Sephadex gel chromatography, and preliminarily separate walnut skin protein according to the molecular weight. The results of bacteriostasis test and cell proliferation test showed that walnut kernels had bacteriostasis and anti-cancer effects. The inhibitory activity of walnut kernels on Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus faecalis was the best. MIC (minimum inhibitory concentration) values were 14.5 and 7.5 ug/mL, respectively. At 120 ug/mL, the survival rates of Huh7 (human hepatoma cells) and SGC (human gastric adenocarcinoma cells) were 50% and 50%, respectively. Only 10%. The walnut kernel peel small molecular protein provided by the invention can be used in antibiotics and anticancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用
本专利技术涉及核桃蛋白质
，具体涉及核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。
技术介绍
核桃仁的皮营养丰富，含有丰富的矿物质和维生素。含有碳水化物，钙，磷，铁，硫胺素，核黄素，尼克酸，这些营养价值较高，而且这些在常见食物中很难补充。核桃的皮含有丰富的维生素B和E，可防止细胞老化，具有健脑、增强记忆力及延缓衰老的功效。核桃中还含有特殊的维生素成分，不但不升高胆固醇，还能减少肠道对胆固醇的吸收，适合动脉硬化、高血压和冠心病人食用。核桃仁的皮含有亚麻油酸及钙、磷、铁，是人体理想的肌肤美容剂，经常食用有润肌肤、乌须发，及具有防治头发过早变白和脱落的功能。现有的关于核桃营养研究多是关于核桃仁的，核桃内种皮相关研究少，特别是关于小分子蛋白提取及应用。现有的获得小分子蛋白的方法多是化学水解和酶水解，所得小肽是大分子蛋白水解而得，直接分离纯化获得小分子蛋白的方法亟待开发。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。通过凝胶层析原理，按照分子质量分离大小不同的核桃仁皮中的蛋白质，取分子量最小的蛋白混合物进行活性检测，所得小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌有较好的抑菌效果，可以应用于相关抗菌药物中；所得小分子蛋白对Huh7和SGC细胞的增殖有抑制效果，但对正常细胞并没有影响，具有应用于抗癌治疗的前景。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是：一种提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，包括以下步骤：(1)获得核桃仁皮总蛋白将核桃仁皮剪碎，加入0.1MPB溶液(Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0)和蛋白酶抑制剂，低温研磨，直至核桃仁皮被磨成均匀的糊状；对上述研磨液进行超声波破碎，离心，吸取上清液，核桃仁皮总蛋白溶解于上清液中；(2)分离核桃仁皮小分子蛋白将步骤(1)得到的蛋白上清液进行凝胶过滤层析，用PB溶液进行洗脱，根据吸收值收集整合各峰组分。进一步，上述方法所用的核桃是新鲜采摘的，所述核桃仁皮是湿润的。优选的，步骤(1)中，进行研磨时，每1mg核桃仁皮加入300μLPB溶液。优选的，上述步骤(2)进行凝胶过滤层析的方法是：选用SephadexG-50凝胶过滤柱(100×2.6cm，GEHealth)进行分离，用PB溶液进行洗脱，连接全自动部分收集器进行样品收集，设置流速为0.3mL/min，每10min收集一管。使用分光光度计每隔一管测定280nm和215nm吸光度值。根据吸收值收集整合各峰组分。上述提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的抑菌剂中的应用。上述应用中核桃仁皮小分子蛋白对绿脓杆菌的MIC值是14.5μg/mL；核桃仁皮小分子蛋白对粪肠球菌的MIC值是7.5μg/mL。上述提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抗癌和抑菌制剂中的应用。一种抑菌药物，所述药物包含核桃仁皮小分子蛋白。进一步，上述抑菌药物可以抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的生长。一种抗癌制剂，所述制剂包含有治疗效果剂量的核桃仁皮小分子蛋白。进一步，所述抗癌制剂用于治疗人胃腺癌或人肝癌。有益效果：本专利技术利用葡聚糖凝胶层析原理，按照分子量大小将核桃仁皮中的蛋白进行初步分离，将核桃仁皮中的小分子蛋白作为活性研究对象。提取小分子蛋白的方法简单易实施，且提取的是核桃仁皮中含有的天然的小分子蛋白。通过抑菌试验和细胞增殖试验发现，核桃仁皮中的小分子蛋白具有抑制微生物和癌细胞生长的活性。所述小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌的抑制活性最好，MIC(最小抑菌浓度)值分别为14.5、7.5μg/mL；在作用浓度为120μg/mL时，Huh7(人肝癌细胞)的存活率为50％、SGC(人胃腺癌细胞)的存活率仅为10％。本专利技术所提供的核桃仁皮小分子蛋白来源于天然的可食用的核桃，相对于现有的化合药物更为健康，具有开发成药物的潜能。附图说明图1是细胞增殖实验细胞存活率统计结果图中，横坐标表示所提取的核桃仁皮小分子蛋白的作用浓度，纵坐标表示存活率；图中相关英文解释：Huh7，人肝癌细胞；SGC，人胃腺癌细胞；macrophage，巨噬细胞；HEK293，人胚肾细胞；splenocyte，脾细胞。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一：核桃仁皮小分子蛋白的提取分离1、核桃仁皮的获得购买新鲜的核桃，撕下湿润的核桃仁皮，清水冲洗干净。2、获得核桃仁皮水溶蛋白将核桃仁皮剪碎，加入0.1MPB溶液(Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0)和蛋白酶抑制剂，在研钹中进行研磨，研磨过程在冰上保持低温进行，每1mg核桃仁皮加入300μLPB溶液。将核桃仁皮研磨成均匀的糊状后，用PB溶液稀释一倍。用超声波细胞破碎仪对所得核桃仁皮研磨液进行超声破碎(超声3sec，暂停3sec，每10min为一个循环，每个循环间隔20min，共三个循环)，超声前在超声溶液中加入玻璃砂以使细胞壁充分破裂，超声过程中核桃仁皮研磨液在冰上保持低温状态，超声后进行离心(4℃，12000×g，2h)，小心吸取上层清液。核桃仁皮中的水溶性蛋白在所得上清液中。3、获得核桃仁皮中的小分子蛋白将上一步得到的蛋白上清液经0.22μm滤器过滤后取5mL(蛋白量约为100mg)按照使用说明上样于已用缓冲液平衡好的SephadexG-50凝胶过滤柱(100×2.6cm，GEHealth)中。用相同PB进行洗脱，连接全自动部分收集器进行样品收集，设置流速为0.3mL/min，每10min收集一管。使用分光光度计每隔一管测定280nm和215nm吸光度值。根据吸收值收集整合各峰组分。将所得到的每个蛋白峰样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，所用蛋白胶浓度为12％。实验通过SephadexG-50葡聚糖凝胶过滤层析从核桃仁皮中分离得到三个蛋白峰，经蛋白电泳检测，最小的蛋白峰的蛋白分子量都在10kD以下。实施例二：核桃仁皮小分子蛋白的抗菌作用1透析处理对实施例一提取分离得到的核桃仁皮小分子蛋白溶液进行透析，降低其中的盐浓度。透析袋有一定的截留分子量，高于此分子量的大分子物质比如蛋白质不能通过，而一些小分子物质比如无机盐、单糖可以通过半透膜，这样可以使得蛋白质分子和小分子物质分开。透析时把核桃仁皮小分子蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液蒸馏水中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质逐渐降低到最小值为止。透析完成后对蛋白液进行低温冷冻干燥，得到蛋白干粉。2抗菌实验2.1MIC值检测实验检测的细菌和真菌标准菌株包括革兰氏阳性菌：松鼠葡萄球菌(staphylococcussciuri)、溶血性葡萄球菌(staphylococcushaemolyticus)、表皮葡萄球菌(stagphylococcusepidermidis)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtitles)、金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)；革兰氏阴性菌：伤寒沙门氏杆菌(salmonel本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)获得核桃仁皮总蛋白将核桃仁皮剪碎，加入0.1M PB溶液和蛋白酶抑制剂，低温研磨，直至核桃仁皮被磨成均匀的糊状；对上述研磨液进行超声波破碎，离心，吸取上清液，核桃仁皮总蛋白溶解于上清液中；(2)分离核桃仁皮小分子蛋白将步骤(1)得到的蛋白上清液进行葡聚糖凝胶过滤层析，用0.1M PB溶液进行洗脱，根据吸收值收集整合各峰组分。

【技术特征摘要】
1.一种提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)获得核桃仁皮总蛋白将核桃仁皮剪碎，加入0.1MPB溶液和蛋白酶抑制剂，低温研磨，直至核桃仁皮被磨成均匀的糊状；对上述研磨液进行超声波破碎，离心，吸取上清液，核桃仁皮总蛋白溶解于上清液中；(2)分离核桃仁皮小分子蛋白将步骤(1)得到的蛋白上清液进行葡聚糖凝胶过滤层析，用0.1MPB溶液进行洗脱，根据吸收值收集整合各峰组分。2.根据权利要求1所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：所述核桃仁皮取自新鲜采摘的核桃，核桃仁皮是湿润的。3.根据权利要求1所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，进行研磨时，每1mg核桃仁皮中加入PB溶液的体积是300μL。4.根据权利要求1所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)进行葡聚糖凝胶过滤层析的方法是：选用SephadexG-50凝胶过滤柱进行蛋白分离，用0.1MPB溶液进行洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：阚欢，刘云，范方宇，郭磊，张雪春，郭安，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53