一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。本发明专利技术所需样本量少，灵敏度高，检测背景信号低，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠；进一步，通过同时检测脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原及隐球菌荚膜多糖抗原的含量，能够对脑膜炎的类型有一个大致的判断，可有效减小临床诊断时因经验主义出现误诊的可能性，为脑膜炎类型的确诊提供了较为准确的免疫学依据。

A time-resolved fluorescence immunochromatographic strip for preliminary screening of meningitis types and its preparation method

The invention discloses a time-resolved fluorescence immunochromatographic test strip for preliminary screening of meningitis types and a preparation method thereof. The time-resolved fluorescence immunochromatographic test strip for preliminary screening of meningitis types includes: sample bonding pad, detection pad, sample suction pad and bottom plate. Sample bonding pad, detection pad and sample suction pad are arranged on the bottom plate in turn, and sample bonding pad and sample suction pad are arranged on the bottom plate in turn. The pad is superimposed on both ends of the test pad, and the test pad is equipped with four detection lines and one quality control line. The method has the advantages of small sample size, high sensitivity, low detection background signal, strong specificity, wide linear range, simple operation and reliable results; furthermore, by simultaneously detecting PCT, CRP, ESAT-6-CFP10 antigen and cryptococcal capsular polysaccharide antigen in cerebrospinal fluid, the type of meningitis can be roughly judged, and the empiricism in clinical diagnosis can be effectively reduced. The possibility of misdiagnosis provides a more accurate immunological basis for the diagnosis of meningitis.

【技术实现步骤摘要】
一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，属于生物

技术介绍
中枢神经系统感染是儿科常见病和多发病，以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎最为多见。近年来，随着结核杆菌的基因突变、抗结核药物研制相对滞后和AIDS病患者的增多，国内外结核病的发病率及病死率逐渐增高。同时，随着抗生素、免疫抑制剂和皮质激素的广泛应用，机体菌群失调或免疫功能下降，使得隐球菌性脑膜炎的发病率也明显升高。由于这几种脑膜炎表现出来的病症有着相似性，尤其是结核性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎在临床上表现酷似，容易误诊，病患得不到及时的有效治疗从而丧命。因此急需寻找一种能早期诊断及鉴别脑膜炎病因的方法，对治疗、预后、转归、减少患者出现后遗症将有极大的临床意义。众多研究表明，在细菌性和病毒性脑膜炎患者中，脑脊液中PCT和CRP的水平均显著高于健康儿童，这说明脑脊液中PCT和CRP可以作为儿童病毒性和细菌性脑膜炎临床诊断的指标。由于感染结核分枝杆菌(MTU)体内首先出现结核抗原，而结核抗体则要感染后8周起逐渐产生，因此检测脑脊液中的MTU分泌特异性抗原可作为快速诊断脑膜活动性结核的有效途径。在感染早期，致病型结核分枝杆菌一般会分泌大量的特异性蛋白，即6000～早期分泌性抗原靶(ESAT～6)与抗原培养滤液蛋白10(CFP10)，并且这两种蛋白不存在卡介苗BCG中，故其可以作为活动性结核的标志物。对于隐球菌性脑膜炎，国内多采用脑脊液图片、阿利新蓝染色、墨汁染色和真菌培养等方法，虽然真菌培养是确诊隐脑的金标准，但耗时较长，需2～5d，有的真菌需要10d，培养阳性率低；涂片和墨汁染色阳性率较高，尤其是对脑脊液离心后镜检，可提高阳性率，但仍然存在漏检和误诊的情况，造成患者不能及时治疗。
技术实现思路
本专利技术提供一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法，本专利技术试纸条通过免疫层析法，配合使用荧光免疫分析仪，可以方便、准确且高灵敏度地同时检测出脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原、隐球菌荚膜多糖抗原的含量，为脑膜炎类型的初判提供一定的理论依据。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。上述试纸条的检测指标包括脑脊液中PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原和隐球菌荚膜多糖抗原；样品结合垫内包被有时间分辨荧光微球标记的抗体，时间分辨荧光微球标记的抗体为检测指标的抗体。为了提高检测的准确性，样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体和抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。为了方便制造，并保证检测的准确性，时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球；聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，聚苯乙烯微球的粒径为100～500nm，优选为180～300nm。为了提高检测的灵敏度，时间分辨荧光微球内部填充有1％(w/w)镧系元素的螯合物，镧系元素为铕、钐、鈊或镝中的一种。申请人经研究发现，采用免疫法测定脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原的含量对隐脑的诊断及疗效观察有重要临床应用价值，灵敏度高，操作简单，适合推广；时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度，同时具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰等优点。上述时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1)将时间分辨荧光微球溶于缓冲液中，加入活化剂恒温震荡活化；2)将步骤1)所得的物料中加入有机溶剂，混匀后，离心、洗涤除去活化剂，用缓冲液重悬微球，随后分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，恒温震荡标记，离心后用复溶缓冲液重悬，加入封闭剂进行封闭，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物，用于PCT、CRP、ESAT～6～CFP10抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原性能的评估。优选，步骤1)和步骤2)中的活化剂为1～(3～二甲氨基丙基)～3～乙基碳二亚胺盐酸盐或/和N～羟基琥珀酰亚胺。优选，时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1)将时间分辨荧光微球用pH6100mM的MES缓冲液清洗2次后重悬，加入活化剂EDC(1～(3～二甲氨基丙基)～3～乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N～羟基琥珀酰亚胺)，使它们的浓度分别为0.05％～0.1％和0.1％～02％，30±5℃振荡活化60±5min；2)将步骤1)所得的物料中加入体积浓度为10％的乙醇，混匀后，离心、洗涤除去EDC或NHS，加入缓冲液重悬微球，混匀后再分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，37℃振荡标记2h，离心后用复溶缓冲液重悬，加入10％BSA封闭30min，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT～6～CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物。上述复溶缓冲液包括Tris～Hcl、BSA、T～20、海藻糖和NaN3；优选地，复溶缓冲液为10～50mM的Tris～Hcl(pH7.5～8.5)，含有0.05～0.1％BSA、0.05～0.1％T～20、3～5％海藻糖和0.05％NaN3，前述百分比为质量百分比。为了避免相互影响，四条检测线相互平行，四条检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的配对抗体所形成的涂层，即采用双抗体夹心法检测各目标物的含量。优选，四条检测线和一条质控线相互平行，且沿着检测垫的长度方向依次设置，从样品结合垫到吸样垫的方向上，依次是四条检测线和一条质控线。也即四条检测线在检测垫上的前后顺序可以任意排列，质控线距离吸样垫的端部最近。为了提高检测的灵敏度和准确性，优选，质控线包被有羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG。作为本申请的另一种优选方案，检测垫包括2～4条检测分垫，四条检测线随机地分布在检测分垫上，每条检测分垫上均设有一条质控线，同一检测分垫上，相比于检测线质控线离吸样垫的端部最近。为了降低成本，同时保证检测的灵敏度和准确性，检测垫为硝酸纤维素膜、且为孔径5～12um的多孔膜；样品结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布；吸样垫的材质为吸水滤纸。上述可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括顺序相接的如下步骤：(1)检测垫的处理：将检测垫贴在底板上，取含有1～5w本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。

【技术特征摘要】
1.一种可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：包括：样品结合垫、检测垫、吸样垫和底板，样品结合垫、检测垫和吸样垫依次设置在底板上，且样品结合垫和吸样垫分别叠压在检测垫的两端上，检测垫上设有四条检测线和一条质控线。2.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：其检测指标包括脑脊液中PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原和隐球菌荚膜多糖抗原；样品结合垫内包被有时间分辨荧光微球标记的抗体，时间分辨荧光微球标记的抗体为检测指标的抗体。3.如权利要求1所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：样品结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体和抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体。4.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球为修饰过的聚苯乙烯微球；聚苯乙烯微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，聚苯乙烯微球的粒径为100～500nm。5.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球内部填充有1wt％镧系元素的螯合物，镧系元素为铕、钐、鈊或镝中的一种。6.如权利要求2或3所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：时间分辨荧光微球标记的方法为：包括顺序相接的如下步骤：1)将时间分辨荧光微球溶于缓冲液中，加入活化剂恒温震荡活化；2)将步骤1)所得的物料中加入有机溶剂，混匀后，离心、洗涤除去活化剂，用缓冲液重悬微球，随后分别加入抗PCT单克隆抗体、抗CRP单克隆抗体、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体，恒温震荡标记，离心后用复溶缓冲液重悬，加入封闭剂进行封闭，得到时间分辨荧光微球标记的抗PCT单克隆抗体复合物、抗CRP单克隆抗体复合物、抗ESAT-6-CFP10多克隆抗体复合物及抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体复合物，用于PCT、CRP、ESAT-6-CFP10抗原以及隐球菌荚膜多糖抗原性能的评估。7.如权利要求6所述的可对脑膜炎类型进行初筛的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：步骤1)和步骤2)中的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或/和N-羟基琥珀酰亚胺；步骤2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明航，蒋帅南，苏雪峰，赵晓芳，郭向前，王宇峰，
申请(专利权)人：江苏苏博生物医学科技南京有限公司，江苏苏博生物医学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32