一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。其中检测试纸条由PVC背板、吸水垫、样品垫、喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）的硝酸纤维素膜（NC膜）构成。试剂盒用于检测鸡蛋或牛奶中黏菌素残留，无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用
本专利技术属于兽药残留快速检测
，涉及一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用。
技术介绍
硫酸黏菌素是碱性多肽类抗生素，主要用于防治敏感菌的感染和促进畜禽生长。硫酸黏菌素可以与细胞膜脂蛋白游离磷酸盐结合，使得细胞膜表面张力减小、通透性增加，导致胞浆外流，细胞死亡。硫酸黏菌素对革兰氏阴性菌(尤其大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、变形杆菌和嗜血杆菌等)有强抑制作用，对革兰氏阳性菌(除金黄葡萄球菌和溶血性链球菌外)和真菌无作用。硫酸黏菌素口服难以吸收，毒性较低，不易造成药物残留，不易产生耐药性。2016年7月26日，我国农业部发布第2428号公告：为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，根据《兽药管理条例》规定，农业部组织开展了硫酸黏菌素安全性评价工作。根据评价结果，农业部决定自2017年4月30日起，硫酸黏菌素将不再允许作为促生长剂添加到饲料中使用。自此硫酸黏菌素的应用被严格限制。2017年11月，农业部办公厅关于征求动物性食品中兽药最大残留限量标准意见的函中明确对黏菌素的残留量做出严格规定，其残留以黏菌素A和黏菌素B合计，牛奶残留限量为50μg/kg，鸡蛋为300μg/kg，畜禽组织为150~200μg/kg不等。大型养殖企业如中粮、伊利集团等对黏菌素的内部限量更为严格。传统的检测黏菌素残留的方法有液相色谱法、液质联用法、酶联免疫法（ELISA）等，其中前两种方法为仪器方法，利用色谱技术对检测样本中的药物残留分离后以紫外分光法或质谱定量检测，其操作繁琐、样本制备要求高、检测成本高、仪器设备价格更是昂贵，基层企业难以承受；酶联免疫法作为基于抗原抗体免疫反应的快速检测方法，具有成本低廉、检测快速等特点，在企业和基层实验室中也有应用，但其本身也有一定缺点，如操作过程需要稳定的温度环境、孵育时间过长、操作精密度要求高等，一般人员不经过训练较难掌握，特别是针对像奶站、奶罐车、鸡蛋收购等场合，较难以胜任。基于以上现有技术的不足和缺陷，有必要开发新的检测方法，满足基层检测实际需求。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，解决基层单位现场检测黏菌素残留的棘手难题和迫切需求，本专利技术提供了一种具有高灵敏度和特异性的黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由P黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。本专利技术提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室、现场检测等领域广泛应用。本专利技术的另外一个目的是提供上述黏菌素胶体金检测试剂盒的制备方法。该制备方法简便、所需原料简单，易于制备、可以在较短时间内制备成功，产生较大经济效益。本专利技术还提供了一种上述黏菌素胶体金检测试剂盒在检测牛奶、奶粉和鸡蛋中黏菌素残留的应用。利用该方法检测时，基层单位如乳品厂、奶站、养殖场等无需恒温箱和酶标仪，无需专门的场地，只要有采集好的样本即可完成检测。整体耗时仅为10min，省时省力。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种具有高灵敏度和特异性的黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成。其中，所述的黏菌素胶体金检测试纸条（图1和图2）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成；其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）（3）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm。检测样本时，样品垫部分浸入检测样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图1箭头方向）爬行。所述的包被有检测抗原的检测线（T线）（3），其检测抗原是与载体蛋白偶联的黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL-OVA。所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向。所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）。所述的吸水垫（6）为玻璃纤维。所述包被有冻干检测抗原（7）的微孔试剂（图3）是将胶体金颗粒标记的黏菌素单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封，其中制备黏菌素单克隆抗体的半抗原为利用丁二酸酐法合成的黏菌素B半抗原CL-HS，其结构式为。所述微孔板架为普通96孔酶标板板架（图4）。所述定量移液管为普通的0.2ml塑料吸管，实际使用时也可以用微量移液器取代。所述样本稀释液是25mMHEPES缓冲液，其中含有1%BSA，3%甘露醇，0.5%trixton-100，2%蔗糖。本专利技术还提供黏菌素胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1黏菌素特异性单克隆抗体的制备：(1)偶联抗原的合成：利用丁二酸酐法合成黏菌素B半抗原CL-HS，然后与牛血清白蛋白、卵清蛋白等载体蛋白通过碳化二亚胺(EDC)法偶联，偶联产物经纯化后紫外测定蛋白浓度，透析除盐后备用；利用黏菌素B直接与载体蛋白偶联合成偶联抗原。(2)动物免疫及抗体筛选：分别利用半抗原CL-HS的偶联抗原和黏菌素B直接偶联抗原CL-BSA免疫干只Balb/C小鼠。首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂佐剂。免疫间隔为2周，3次免疫后以ELISA测定血清效价，同时以竞争ELISA测定血清抑制效价和血清对黏菌素、黏菌素A、黏菌素B的交叉反应。筛选血清效价高、对黏菌素A和B反应良好的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)抗体鉴定：进一步对筛选的单抗进行鉴定，使用的交叉反应物为黏菌素、黏菌素A、黏菌素B、杆菌肽、庆大霉素、卡那霉素、四环素、头孢噻呋等，通过筛选排除对无关物质有交叉反应的单抗细胞株，保留只与黏菌素及其代谢物反应的细胞株。扩大培养后以体内法诱生腹水，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以ProteinG柱纯化，测定蛋白浓度后冻存。2胶体金标记黏菌素特异性单抗微孔试剂的制备以柠檬酸钠还原法制备粒径为40nm胶体金颗粒备用。取0.01%氯金酸水溶液加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入体积比为1.5%~2.5%的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2~8℃保存。将纯化的黏菌素特异性单克隆抗体至一定浓度用制备好的胶体金颗粒标记后用定量分液器以100~150μl/孔的量包被在酶标板微孔（8）中，然后2~8℃孵育一定时间，洗板后封闭，再次洗板拍干备用；将包被有金标抗原的酶标板使用冻干机冷冻干燥后盖酶标板孔盖（9）密封后作为微孔试剂储存在2~8℃干燥环境中备用。3划膜及组装将检测抗原（T线抗原）和质控线抗抗体用0.01MPBS（pH7.2）缓冲液稀释至一定浓度，用划膜仪喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成，其中：所述的黏菌素胶体金检测试纸条（图1和图2）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成，其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）（3）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm，检测样本时，样品垫部分浸入检测样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图1箭头方向）爬行；所述的包被有检测抗原的检测线（T线）（3），其检测抗原是将黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL‑OVA；所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向；所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温‑20的0.01M 磷酸盐缓冲液（pH7.2）；所述的吸水垫（6）为玻璃纤维；所述包被有冻干检测抗原（7）的微孔试剂（图3）是将胶体金颗粒标记的黏菌素单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封，其中制备黏菌素单克隆抗体的半抗原为利用丁二酸酐法合成的黏菌素B半抗原CL‑HS，其结构式为：...

【技术特征摘要】
1.一种黏菌素胶体金检测试剂盒，其主要由黏菌素胶体金检测试纸条、冻干的胶体金标记黏菌素特异性单克隆抗体微孔试剂、微孔板架、定量移液管、样本稀释液组成，其中：所述的黏菌素胶体金检测试纸条（图1和图2）由PVC背板（1）、硝酸纤维素膜（NC膜）（2）、样品垫（5）、吸水垫（6）构成，其中硝酸纤维素膜（2）为整个检测反应的载体，粘贴在PVC背板（1）上，其上喷涂有包被有检测抗原的检测线（T线）（3）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4）的，其T线端粘贴有样品垫（5），样品垫的上端与T线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm；其C线端粘贴有吸水垫（6），吸水垫与C线的距离为4~10mm，并与NC膜重合约1~3mm，检测样本时，样品垫部分浸入检测样本，确保样本能在虹吸作用下沿胶体金试纸条由样品垫向吸水垫方向（图1箭头方向）爬行；所述的包被有检测抗原的检测线（T线）（3），其检测抗原是将黏菌素B与卵清蛋白的偶联物CL-OVA；所述的包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线）（4），在包被时还可加入染料，标记出C线位置，以方便客户检测时识别试纸条的方向；所述的样品垫（5）为玻璃纤维或纤维素或者纺织聚合物，其经过缓冲液浸泡后晾干，所述缓冲液为含有5%蔗糖、3%甲醇、0.5%吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）；所述的吸水垫（6）为玻璃纤维；所述包被有冻干检测抗原（7）的微孔试剂（图3）是将胶体金颗粒标记的黏菌素单克隆抗体稀释至一定浓度，冷冻干燥在酶标微孔（8）中，然后用酶标板孔盖（9）密封，其中制备黏菌素单克隆抗体的半抗原为利用丁二酸酐法合成的黏菌素B半抗原CL-HS，其结构式为：；所述微...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，于在江，赵荣茂，袁志波，白民俊，吴迪，李月，孙奇武，秦丽丽，李慧俐，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11