检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原免疫胶体金试纸条及制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原免疫胶体金试纸条及制备方法及应用，免疫胶体金试纸包括硬质聚氯乙烯背衬板、硝酸纤维膜、样品垫、胶体金结合垫吸水垫，硝酸纤维膜粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维膜的另一端上；步骤：（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；（2）将兔抗黄盖鲽鱼卵黄蛋白原单克隆抗体标记在胶体金颗粒上；（3）将兔抗黄盖鲽鱼卵黄蛋白原抗体包被在硝酸纤维膜上；（4）按顺序粘合一起得到胶体金试纸条。一种免疫胶体金试纸条在检测卵黄蛋白原中的应用，该试纸操作简单、检测快速、灵敏、结果清晰易于判断。便于携带和使用，节约了卵黄蛋白原检测成本。

【技术实现步骤摘要】
检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原免疫胶体金试纸条及制备方法及应用
本专利技术涉及一种检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原免疫胶体金试纸条及制备方法及应用，属于环境雌激素的检测

技术介绍
环境雌激素(Environmentalestrogens;EEs)，又称为环境内分泌干扰物质(Environmentalendocrinedisruptionchemicals,EDCs)，是一类外源性化合物，能干扰人类和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢，激素与受体的结合、功能的表达等一系列过程，从而扰乱内分泌系统、神经系统和免疫系统的调控功能，造成生殖器官异常，雄性生物雌性化等现象，甚至造成对生物后代生殖功能的潜在影响。目前，环境雌激素已成为继臭氧层破坏、全球气候变暖之后的第三大环境问题。EEs分布广泛，种类繁多，并且随着工业化的进程，EEs的污染有进一步扩大的趋势，不仅威胁到动物种群的存亡，也成为人类健康的潜在威胁因素。各国政府、WHO等组织高度重视，美国国家资源委员会将其列为5个最优先项目之一。因此，必须建立一套快速简便、科学灵敏的EEs检测方法，对EEs做出科学、综合的评价，以保护人类健康。生物检测方法具有简便、快捷、特异性好的优点，不仅可以测定海洋生物是否受到EEs的污染，还能评价环境中EEs对生物体的危害程度，尤其适用于大批量样品中EEs的境检测，但生物分析方法也存在一定问题，它无法区分环境样品中EEs的组分。因此，将生物检测与分析化学方法配合使用则成为一种趋势，可节省大量的人力物力，使EEs常规性检测成为可能。生物检测方法一般分为生物标志物、生物检测方法一般分为生物标志物检测法、免疫胶体金法和生物传感器测定法。1、生物标志物检测法“生物标志物”（Biomarker）是指在外源物质诱导下，引起生物系统内在细胞水平，生化组成、过程、结构、功能的可测变化，是可以检测的亚有机体单位，能够提供一种或几种化学污染物的暴露和/或毒性效应的证据。生物标志物检测法就是利用生物分子较高的分子识别功能，结合切换功能，来测定有机污染物。生物标志物在生物监测中具有感知作用，被广泛的用于生态环境恶化的早期预警（earlywarning）；风险评价（riskassessment）；生态系统的健康评价（ecosystemhealthassessment）。由于生物标志物在生物检测中给出的是生物学信息，所以对于管理、保护和维护自然生态系统非常重要。将生物标志物检测技术应用于海产品中EEs检测，是对EEs化学检测方法的补充，通过标志物含量的高低来反映生物体受EEs影响的程度，分析水产品中EEs富集水平。这种方法的特点是更具目地性、快速、不需专业人员操作、降低被检样品的数量，从而节约成本和资源。2003年全球环境基金（GlobalEnvironmentFacility，GEF）的科学技术顾问团（TheScientificandTechnicalAdvisoryPanel，STAP）提出利用生物标志物对环境中POPs进行监测；全球海洋环境污染物调查（GlobalInvestigationofPollutionoftheMarineEnvironment，GIPME）也利用生物标志物测定污染物在海洋生物中的作用；而德国和英国等发达国家已经将生物标志物检测作为国家监测计划中的一部分以降低成本，提高监测效率。经济合作与发展组织(OECD)将卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)作为环境雌激素化学物理想的暴露标志物。内源性雌激素或外源性雌激素能刺激卵生动物肝细胞(作用于肝雌激素受体)产生Vtg，经血运输到卵巢，作为卵黄蛋白的营养支持。在鱼类中，雌鱼在卵黄生成期可合成大量Vtg，而在其他生活期及雄鱼体内的Vtg的含量很低。但雄鱼在环境雌激素长期作用下，也能诱导体内Vtg的生成。根据这一特性，检测雄性鱼体血浆或体表粘液中的Vtg可以评价环境中化学物质的雌激素效应，也可以评价水产品是否受到EEs的污染。因此，可以考虑将Vtg作为EEs生物标志物的首选。目前已经有ELISA与免疫组化方法检测样品中的Vtg，进行EEs污染状况评价。2.免疫胶体金技术ELISA与免疫组化方法虽然能准确的检测大批量样品中的Vtg含量，但是这些方法通常需要较长的检测时间，步骤较为复杂，且需要仪器来辅助，对操作人员要求高，因此需要建立一种野外快速检测Vtg的方法。免疫胶体金层析方法(Goldimmunochromatographicassay，GICA)是一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法。由于具有成本低廉，快速简便，结果直观，特异性强等优点，目前已广泛用于检测领域中。因此本文利用制备的胶体金颗粒，通过NaCl破坏实验确定抗体标记的最佳的PH值和蛋白量，并利用标记好的单克隆抗体建立了两种胶体金免疫层析方法，分别优化了最佳的T线和C线浓度，确立了最佳的标准曲线，用建立的胶体金免疫层析方法检测了EE2对黄盖鲽的雌激素效应。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，自其问世以来在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。近年来，研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。当前，检测Vtg主要有ELISA、WesternBlotting和色谱分析等方法。但这些测试手段主要是在实验室内进行，需要拥有较复杂的实验条件和具备良好的实验技能。而免疫胶体金技术的应用可以开发一种操作简单、价格便宜、能够适应野外现场检测的卵黄蛋白原检测手段。目前这方面的研究还很少，杨方星与徐盈(2007)开发了斑马鱼原位检测类雌激素暴露的胶体金免疫检测试片，检出限为10μg/ml。由于该方法使用多克隆抗体，其检测敏感性远高于ELISA与WesternBlotting的检出限，并且其特异性还有待进一步验证。因此本专利技术利用制备的胶体金颗粒，通过NaCl破坏实验确定抗体标记的最佳的PH值和蛋白量，并利用标记好的单克隆抗体建立了两种胶体金免疫层析方法，分别优化了最佳的T线和C线浓度，确立了最佳的标准曲线，用建立的胶体金免疫层析方法检测了EE2对黄盖鲽的雌激素效应。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：一种能检测黄蝶鱼卵黄蛋白原的免疫胶体金试纸条，所述的试纸条包括有硬质聚氯乙烯背衬板、硝酸纤维膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫。硝酸纤维膜粘贴在硬质聚氯乙烯背衬板上面，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原的免疫胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯背衬板（1）、硝酸纤维膜（2）、样品垫（3）、胶体金结合垫（4）吸水垫（5），其特征在于：硝酸纤维膜（2）粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板（1）上，在硝酸纤维膜（2）的一端粘贴有胶体金结合垫（4），在胶体金结合垫（4）上粘贴有样品垫（3），吸水垫（5）置于硝酸纤维膜（2）的另一端上；所述的胶体金结合垫（4）喷涂有抗黄盖鲽鱼vtg单克隆抗体‑ 胶体金标记物；所述的硝酸纤维膜（2）上分别喷涂有兔抗黄盖鲽鱼卵黄磷脂蛋白（LV）抗体多克隆抗体检测线（6）和羊抗鼠抗体的质控线（7）。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原的免疫胶体金试纸条，包括硬质聚氯乙烯背衬板（1）、硝酸纤维膜（2）、样品垫（3）、胶体金结合垫（4）吸水垫（5），其特征在于：硝酸纤维膜（2）粘贴于在硬质聚氯乙烯背衬板（1）上，在硝酸纤维膜（2）的一端粘贴有胶体金结合垫（4），在胶体金结合垫（4）上粘贴有样品垫（3），吸水垫（5）置于硝酸纤维膜（2）的另一端上；所述的胶体金结合垫（4）喷涂有抗黄盖鲽鱼vtg单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维膜（2）上分别喷涂有兔抗黄盖鲽鱼卵黄磷脂蛋白（LV）抗体多克隆抗体检测线（6）和羊抗鼠抗体的质控线（7）。2.根据权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于：所述的硝酸纤维膜（2）为试纸条的检测膜，上面靠左侧的是检测线（6），质控线（7）位于右侧，两条线的间隔距离是4～6mm。3.权利要求1所述的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤如下：（1）将制金用烧杯、锥形瓶、容量瓶等玻璃器皿置于铬酸溶液中浸泡24h后用自来水清洗10遍，用双蒸水清洗10遍，烘干后备用；量取99mL的超纯水装入250m...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆杰，王松，赵祖亮，王骏，毕乐飞，崔鹤，姜勇，相湛昌，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37