一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法技术

提供了一种检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的快检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：1）阴性质控品、2）阳性质控品、3）包被有多克隆抗体的酶标板、4）酶标多肽特异性单克隆抗体溶液、5）显色底物、6）终止液、7）洗涤液。利用该试剂盒，可在较短时间内检测出羊乳及羊乳粉中牛乳成分掺假，维护市场。针对当前乳品质量监管的复杂形势，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。

【技术实现步骤摘要】
一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于乳品质量检测领域，涉及一种羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
乳及其制品已经成为重要动物源性食品。特别是近些年来，随着人们生活水平的提高和我国奶业的迅速发展，生鲜乳作为普通食品已被广泛接受。羊乳作为重要乳品，其蛋白质和维生素含量高，脂肪颗粒小，与牛乳相比较更容易吸收，市售价格也是牛乳的数倍。陕西、山东等地是我国羊奶及羊奶粉的重要产区，产品已经出口至欧盟。由于羊奶价格高、产量低，生产者为了获取更多经济利益，往往在其中掺入部分牛乳，以提高经济效益。牛乳掺入后，虽没有带来风险因子，但其降低了羊奶的营养水平及最后羊奶粉产出的质量，就有可能造成易感人群过敏反应，以及产生国际贸易争端和扰乱市场秩序。因此非常有必要建立快速方便的检测方法，对羊乳中掺有牛乳成分检测，以确保优质羊乳及羊乳粉的品质，维护市场秩序。羊乳与牛乳均为天然产品，成分近似，主要区别在于部分营养指标含量不同，以及部分蛋白质成分差异，这也是目前区分牛羊乳成分的重要参数。如西班牙ZEULab公司开发的生鲜羊乳中牛乳成分检测试剂盒，利用牛免疫球蛋白（IgG）成分与羊乳IgG的差异，通过免疫胶体金检测方法检测，整个过程耗时短，检测灵敏度高，受到了市场的认可。但该方法还有一定缺陷，羊乳（牛乳）在高温喷粉之后，IgG成分几乎损失殆尽，以IgG检测标志物就无法检测羊乳粉中牛乳成分；以β-乳球蛋白为检测标志物也有类似缺陷。此外，利用PCR检测乳品中残留的DNA成分也可以用于区分羊乳与牛乳差异，但其操作繁琐复杂，无法现场检测及在基层开展应用。研究表明，牛羊乳中的酪蛋白是一种热稳定性蛋白，高温处理并不能使其破坏，因此可以用酪蛋白的差异来判定羊乳和牛乳差别。进一步对牛羊乳酪蛋白成分分析表明，牛乳中含有的α-酪蛋白、β-酪蛋白、γ-酪蛋白等与羊乳中的相应成分有一定差异。通过合适的方法检测此差异并与质控样本对比，即可检测羊乳中是否添加牛乳成分。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的快速检测试剂盒，该试剂盒可以在较短时间内检测出羊乳中是否添加牛乳，并与试剂盒中提供的参考样品相比给出半定量及定量参考结果。本专利技术提供的检测试剂盒无需昂贵设备，操作简便，无需特殊培训，检测灵敏度高，非常适合基层实验室检测应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种快速检测羊乳及羊乳粉中掺有中牛乳成分的检测试剂盒，包括：1）阴性质控品；2）阳性质控品；3）包被有多克隆抗体的酶标板；4）酶标多肽特异性单克隆抗体溶液；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液。其中，所述阴性质控为不含有牛乳成分的复原羊乳，含有0.03%的叠氮钠作为防腐剂，所述阳性质控为经过亲和纯化的牛酪蛋白标准品溶液，其中酪蛋白浓度为1mg/mL，稀释液为0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液，含有0.05%的叠氮钠作为防腐剂。所述包被有多克隆抗体的酶标板，其包被的多克隆抗体为有序列为SEQIDNo.1所示的多肽与载体蛋白偶联后免疫新西兰兔制备的。所述酶标多肽特异性单克隆抗体溶液为利用如序列SEQIDNo.1所列的多肽与载体蛋白偶联作为免疫原制备的单克隆抗体，其能特异性地与牛酪蛋白反应，而与羊酪蛋白反应较小（交叉反应<1%）。所述显色底物为单组份TMB显色底物等。所述终止液为0.5~2M硫酸溶液。所述浓缩洗液为添加有吐温-20的PBS溶液。进一步地，上述阳性质控中经过亲和纯化的牛酪蛋白标准品是将采购的牛酪蛋白标准品用上述SEQIDNo.1所列的多肽与载体蛋白偶联作为免疫原制备的单克隆抗体亲和纯化，并除去其中杂质和与所述单克隆抗体不发生反应的成分后获得的亲和纯化酪蛋白。进一步地，为了定量检测待测样本中牛酪蛋白含量，所述试剂盒组成中还加入经亲和纯化的牛酪蛋白系列标准品，例如标准品的浓度可为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1mg/mL，通过试剂盒检测后酶标仪测定吸光度值，绘制试剂盒反应的标准曲线，对未知样本中的酪蛋白定量检测。本专利技术还涉及一种使用检测试剂盒检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测方法，其中包括如下步骤：第一步，将待测样本用0.01MPBS（pH7.2）按照一定比例稀释备用；第二步，将准备好的样品按照检测试剂盒的操作方法进行操作；第三步，利用分析软件分析数据，将检测样本与质控品对照；第四步，根据数据分析结果判定样本中是否添加有牛乳成分。与传统的仪器分析方法相比，本专利技术具有以下有益效果：1）操作简单，无需特殊仪器设备。从试剂、仪器设备来看，本方法无需有机试剂，检测样本经稀释后可以直接检测，降低了操作难度，非常适合于基层检测实验室推广应用。2）耗时短，检测效率高。整体检测时间即酶联吸附检测的反应时间不超过1h。利用酶标板96孔检测，做双孔平行，可以单次实验中同时检测至少40份样本，效率高。3）检测灵敏度高，成本低。方法利用免疫检测技术优势，具有极高的检测灵敏度，可以达到10-6，单次检测成本不超过10元。4）检测结果可定性定量。在有酶标仪的情况下，测定吸光度值，绘制校准曲线，可以定量检测样本中牛乳成分掺入量。没有酶标仪，可以将样本孔的显色与生鲜羊乳（复原羊乳）及牛乳质控品的显色相比较，定性判定样本是否掺有牛乳成分。更为重要的是本专利技术提供的方法可检测乳粉复原后的牛乳掺假，给羊乳粉生产企业及消费者带来了更大方便，给相关产品质量和市场维护提供了有力工具。本专利技术提供的羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的检测试剂盒与传统技术相比较，优势明显，技术改进明显，特别是针对当前乳品质量监管的复杂形势，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。附图说明图1为试剂盒检测的校准曲线，其中x轴为标准品浓度（mg/L），y轴为百分比吸光度值（标准品的吸光度值与0mg/L标准品吸光度值的百分比比值）。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术。本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性质，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。所有材料未说明来源，均可从商业渠道获取。实施例1：免疫抗原的制备通过对Uniprot数据库公布的牛、羊的酪蛋白及β-乳球蛋白的序列信息进行分析，利用生物信息学手段，筛选如SEQIDNo.1所示的多肽序列，并委托第三方服务商合成。具体操作为：利用序列号为P02662的牛alphas1酪蛋白序列、序列号为P18626羊alphas1酪蛋白序列、序列号为P02754的牛β-乳球蛋白、序列为P02756的羊β-乳球蛋白序列，利用序列比对软件分析P02662和P18626的不同位点氨基酸序列、分析P02754和P02756的不同位点氨基酸序列，将两次分析的氨基酸序列分别经过组合、分析，判断其抗原决定簇，最终获得如SEQIDNo.1所示的多肽序列，交第三方公司合成。合成抗原与载体蛋白按照常规方法偶联后备用，偶联抗原可以是任何大分子蛋白，常用载体蛋白有血蓝蛋白、卵清蛋白、血清白蛋白等。根据实际实验结果，以血蓝蛋白（KLH）偶联小分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的快速检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括以下成分：1）阴性质控品；2）阳性质控品；3）包被有多克隆抗体的酶标板；4）酶标多肽特异性单克隆抗体溶液；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液；其中所述阴性质控为不含有牛乳成分的复原羊乳，含有0.03%的叠氮钠作为防腐剂；所述阳性质控为经过亲和纯化的牛酪蛋白标准品溶液，其中酪蛋白浓度为1mg/mL，稀释液为0.01mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，含有0.05%的叠氮钠作为防腐剂；所述包被有多克隆抗体的酶标板，其包被的多克隆抗体为有序列为SEQ ID No.1 所示的多肽与载体蛋白偶联后免疫新西兰兔制备的；所述酶标多肽特异性单克隆抗体溶液为利用如序列SEQ ID No.1所列的多肽与载体蛋白偶联作为免疫原制备的单克隆抗体，其能特异性地与牛酪蛋白反应，而与羊酪蛋白反应较小（交叉反应

【技术特征摘要】
1.一种检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的快速检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括以下成分：1）阴性质控品；2）阳性质控品；3）包被有多克隆抗体的酶标板；4）酶标多肽特异性单克隆抗体溶液；5）显色底物；6）终止液；7）洗涤液；其中所述阴性质控为不含有牛乳成分的复原羊乳，含有0.03%的叠氮钠作为防腐剂；所述阳性质控为经过亲和纯化的牛酪蛋白标准品溶液，其中酪蛋白浓度为1mg/mL，稀释液为0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液，含有0.05%的叠氮钠作为防腐剂；所述包被有多克隆抗体的酶标板，其包被的多克隆抗体为有序列为SEQIDNo.1所示的多肽与载体蛋白偶联后免疫新西兰兔制备的；所述酶标多肽特异性单克隆抗体溶液为利用如序列SEQIDNo.1所列的多肽与载体蛋白偶联作为免疫原制备的单克隆抗体，其能特异性地与牛酪蛋白反应，而与羊酪蛋白反应较小（交叉反应<1%）；所述显色底物为单组份TMB显色底物等；所述终止液为0.5~2M硫酸溶液；所述浓缩洗液为添加有吐温-20的PBS溶液。2.根据权利要求1所述的检测羊乳及羊乳粉中掺有牛乳成分的快速检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春江，于在江，吴迪，孙海霞，冯海玲，秦丽丽，张久龙，郑云鹏，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11