一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法,包括如下步骤：1）不饱和脂肪酸双键的光化学衍生化反应；2）脂肪酸羧基端的N，N‑二乙基乙二胺衍生化反应；3）脂肪酸精准结构的定性方法；4）脂肪酸的定量方法。本发明专利技术利用所建立的方法对实际样品中游离脂肪酸进行精准定性和定量分析，解决了不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的双键位置难以鉴定，以及脂肪酸在负离子模式下电离效率低和检测灵敏度不足的困难，实现了对实际样品中游离脂肪酸高灵敏度、准确的定性定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法
本专利技术涉及一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，以及其在不同生物样本中游离脂肪酸定性定量分析中的应用。技术背景脂肪酸(Fattyacid，FA)是指一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链的一系列有机物，碳链长度不等(C4～C36)，按是否含有双键分为饱和和不饱和脂肪酸。FA是最简单的一类脂质化合物，是其他脂质的重要组分。哺乳动物体内脂肪酸的多样性通过以下途径在细胞功能中发挥多种关键作用：例如组成生物膜中各种不同的功能脂质分子；调节膜的流动性和信号分子之间的相互作用，以及为脂质信号分子的产生提供多种前体物质。脂肪酸结构的多样性包括不同的链长、不同的不饱和度、不同的双键位置、是否存在氧化、支链和其他修饰结构。FA组成和结构的改变对膜功能、生物能量效率和细胞信号转导有很大的影响，从而对机体的营养与健康产生影响。脂肪酸的双键位置与其功能密切相关，脂肪酸根据第一个双键距离甲基端的位置不同，可分为n-3、n-6、n-7和n-9等系列。n-3系列多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFAs)和n-6系列PUFAs在生物体内都发挥了很重要的作用，很多情况下，这两族PUFAs在功能上相互协调制约，共同调节生物体的生命活动。但这两族脂肪酸在很多功能上也存在差异，例如，n-6PUFAs能导致血小板凝集和血栓形成，而n-3PUFAs则有相反的作用。而且与n-6PUFAs相比，n-3PUFAs更能使胰岛素保持较高的敏感性，从而发挥更强的降血糖功能。越来越多的研究表明，脂肪酸的精准结构及其水平与糖、脂代谢异常及其他心血管病的危险因素，如肥胖、高血压等密切相关。游离脂肪酸代谢异常与胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、II型糖尿病等疾病的发生发展相关。衍生化技术(Derivatization)是指待测样品与具有特定基团的衍生化试剂通过定量快速反应生成符合要求的衍生化物，然后通过检测衍生化物的量来间接测定待测样品的量。衍生化后能够改变待测物的检测特性，增加其对检测器的响应，并且能够生成稳定衍生化物改善待测物的不稳定性。同时，衍生化反应能提高选择性，衍生产物的质谱碎裂会高效生成能准确鉴定结构的碎片离子。衍生化技术可提高电离效率，减少复杂样品分析时的电离抑制，进而提高电喷雾质谱分析的灵敏度。衍生化技术适用于生物样品中带有目标官能团的代谢物的准确定性和定量分析。脂肪酸双键位置的质谱鉴定方法有气相色谱串联质谱法，但该方法需要对样本进行复杂的衍生化反应，并且只能对1个双键进行准确鉴定。另外，还有臭氧解离、电子捕获解离等，这些方法需要改造质谱仪，加上特殊的装置才能发生反应；且谱图复杂繁琐，解谱困难，难以应用于分析复杂样本。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足而提供一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，解决了不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的双键位置难以鉴定，在负离子模式下电离效率低和检测灵敏度不足的困难，实现了高灵敏度、准确的定性量分析。本专利技术为解决上述提出的技术问题，所采用的技术方案为：一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，它包括如下步骤：1)不饱和脂肪酸的光化学衍生化反应：将待测样品中加入内标，然后提取游离脂肪酸，得到游离脂肪酸提取液；所得游离脂肪酸提取液以丙酮作为Paternò-Büchi(P-B)反应试剂，在紫外光下进行光化学衍生化反应，得到初次衍生后的待测样品溶液；2)脂肪酸的N，N-二乙基乙二胺衍生化反应：将步骤1)所得初次衍生后的待测样品溶液以N，N-二乙基乙二胺作为衍生试剂进行衍生化反应，得到二次衍生后的待测样品溶液；3)采集数据：将步骤2)所得二次衍生后的待测样品溶液进行质谱分析，选择73Da中性丢失扫描-增强离子扫描作为质谱扫描模式，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；4)定性分析：根据步骤3)所得谱图和谱峰数据，确定对应各脂肪酸衍生物的准分子离子峰；同时对于存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，其所含双键的位置不同，其分别对应的衍生产物在质谱碰撞诱导解离中分别产生不同m/z的诊断离子，确定存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸中所含双键的位置，从而对待测样品中的游离脂肪酸实现定性分析；5)绘制标准曲线：a、选择脂肪酸标准品并用溶剂稀释成一系列浓度的标准溶液，分别加入内标后，在与步骤1)、步骤2)相同的条件下进行两次衍生化反应，得到标准样品的进样溶液；将标准样品的进样溶液按照与步骤3)相同的条件进行质谱分析，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；b、对存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，以标准溶液中不饱和脂肪酸双键位置异构体的浓度比值为横坐标，所对应二次衍生产物诊断离子的强度比值为纵坐标，建立诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线；6)定量分析：由于P-B反应的产率并非100％，且每种不饱和脂肪酸的P-B衍生产率存在差异，因此，定量采用单独的DEEA反应方法减少方法的定量误差。而单独的DEEA反应产物也可采用与二次衍生相同的采集数据方式，根据步骤3)所得谱图中游离脂肪酸衍生物与内标衍生物的准分子离子峰强度比值，结合内标的浓度，对待测样品中的游离脂肪酸进行定量分析；待测样品中存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，根据内标定量得到异构体的总量，然后，根据所对应二次衍生产物的诊断离子强度比值，结合诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线，对待测样品中存在各个双键位置异构体进行定量分析。按上述方案，所述待测样品为人细胞、血液和小鼠肝脏等生物样品。如动物(包括人)的体液(如尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等)、毛发、肌肉和一些组织器官(如胸腺、胰腺、肝、肺、脑、胃、肾等)等。按上述方案，所述步骤5)中，选取生物样本中常见的脂肪酸的标准品。标准溶液为一种或几种游离脂肪酸的混合溶液，且所述标准溶液中游离脂肪酸的浓度范围在0～400nmol/L，内标的浓度范围在50-200nmol/L。按上述方案，步骤1)将待测样品(即生物样品)中加入内标和PBS缓冲溶液，内标的终浓度为50-200nmol/L，经离心处理后丢弃水上层；然后加入DPBS缓冲溶液和甲醇，用盐酸酸化，最终盐酸浓度达到25mM；接着加入异辛烷后，离心分层后去上层，氮吹干；最后用丙酮与水的混合溶液复溶，加入色谱级乙醇后置于250-270nm紫外汞灯下发生P-B反应。按上述方案，所述步骤2)中的衍生化反应中，添加衍生试剂N，N-二乙基乙二胺时，还需要加入2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(2-chloro-1-methylpyridiniumiodide，CMPI)和三乙胺(triethylamine，TEA)作为催化剂，反应温度40℃，反应时间10min。其中，在该衍生化体系中，衍生试剂N,N-二乙基乙二胺的浓度为1μmol/mL，催化剂三乙胺的浓度为0.6μmol/mL，催化剂2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物的浓度为1μmol/mL。按上述方案，步骤2)所得二次衍生后的待测样品溶液和步骤5)所得标准样品的进样溶液一般经过干燥、复溶、纯化等预处理过程再进行质谱分析。按上述方案，所述步骤3)中，质谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，其特征在于它包括如下步骤：1）不饱和脂肪酸的光化学衍生化反应：将待测样品中加入内标，然后提取游离脂肪酸，得到游离脂肪酸提取液；所得游离脂肪酸提取液以丙酮作为Paternò−Büchi反应试剂，在紫外光下进行光化学衍生化反应，得到初次衍生后的待测样品溶液；2）脂肪酸的N，N‑二乙基乙二胺衍生化反应：将步骤1）所得初次衍生后的待测样品溶液以N，N‑二乙基乙二胺作为衍生试剂进行衍生化反应，得到二次衍生后的待测样品溶液；3）采集数据：将步骤2）所得二次衍生后的待测样品溶液进行质谱分析，选择正离子模式电喷雾电离源，选择73Da中性丢失扫描‑增强离子扫描作为质谱扫描模式，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；4）定性分析：根据步骤3）所得谱图和谱峰数据，确定对应各脂肪酸衍生物的准分子离子峰；同时对于存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，其所含双键的位置不同，其分别对应的衍生产物在质谱碰撞诱导解离中分别产生不同特征性m/z的碎片离子，称之为诊断离子，其能确定存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸中所含双键的位置，从而对待测样品中的游离脂肪酸实现定性分析；5）绘制标准曲线：a、选择脂肪酸标准品并用溶剂稀释成一系列浓度的标准溶液，分别加入内标后，在与步骤1）、步骤2）相同的条件下进行两次衍生化反应，得到标准样品的进样溶液；将标准样品的进样溶液按照与步骤3）相同的条件进行质谱分析，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；b、对存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，以标准溶液中不饱和脂肪酸双键位置异构体的浓度比值为横坐标，所对应二次衍生产物诊断离子的强度比值为纵坐标，建立诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线；6）定量分析：根据步骤3）所得谱图中游离脂肪酸衍生物与内标衍生物的准分子离子峰强度比值，结合内标的浓度，对待测样品中的游离脂肪酸进行定量分析；待测样品中存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，根据内标定量得到异构体的总量，然后，根据所对应二次衍生产物诊断离子强度比值，结合诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线，对待测样品中存在各个双键位置异构体进行定量分析。...

【技术特征摘要】
1.一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，其特征在于它包括如下步骤：1）不饱和脂肪酸的光化学衍生化反应：将待测样品中加入内标，然后提取游离脂肪酸，得到游离脂肪酸提取液；所得游离脂肪酸提取液以丙酮作为Paternò−Büchi反应试剂，在紫外光下进行光化学衍生化反应，得到初次衍生后的待测样品溶液；2）脂肪酸的N，N-二乙基乙二胺衍生化反应：将步骤1）所得初次衍生后的待测样品溶液以N，N-二乙基乙二胺作为衍生试剂进行衍生化反应，得到二次衍生后的待测样品溶液；3）采集数据：将步骤2）所得二次衍生后的待测样品溶液进行质谱分析，选择正离子模式电喷雾电离源，选择73Da中性丢失扫描-增强离子扫描作为质谱扫描模式，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；4）定性分析：根据步骤3）所得谱图和谱峰数据，确定对应各脂肪酸衍生物的准分子离子峰；同时对于存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，其所含双键的位置不同，其分别对应的衍生产物在质谱碰撞诱导解离中分别产生不同特征性m/z的碎片离子，称之为诊断离子，其能确定存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸中所含双键的位置，从而对待测样品中的游离脂肪酸实现定性分析；5）绘制标准曲线：a、选择脂肪酸标准品并用溶剂稀释成一系列浓度的标准溶液，分别加入内标后，在与步骤1）、步骤2）相同的条件下进行两次衍生化反应，得到标准样品的进样溶液；将标准样品的进样溶液按照与步骤3）相同的条件进行质谱分析，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；b、对存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，以标准溶液中不饱和脂肪酸双键位置异构体的浓度比值为横坐标，所对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏芳，徐淑玲，吕昕，董绪燕，陈洪，黄凤洪，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42