一种用于多环芳烃污染修复的海藻酸钠固定化组合菌群的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于多环芳烃污染修复的海藻酸钠固定化组合菌群的制备方法。本发明专利技术选用苯并[a]芘作为多环芳烃的代表性模型物，采用海藻酸钠小球作为载体固定化8种细菌(红细菌属P1、黄杆菌属P2、根瘤菌属P3、Mucilaginibacter属P4、黄杆菌属P5、贪铜菌属P6、贪铜菌属P7和贪铜菌属P8)，将含8种细菌的海藻酸钠小球按照P1∶P2∶P3∶P4∶P5∶P6∶P7∶P8＝1∶1∶1∶1∶1∶12∶12∶1的质量比混合，即得到细菌组合。本发明专利技术采用了先固定化再混合的方式得到组合菌群，避免在培养过程中引入多环芳烃的同时保证了细菌组合中各菌株的比例；采用了海藻酸钠包埋法固定化细菌，降低了组合菌群中各菌株间的拮抗作用，提高了细菌组合降解多环芳烃的效率。

Preparation of Sodium Alginate Immobilized Composite Microflora for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Pollution Remediation

The invention discloses a preparation method of sodium alginate immobilized composite microflora for polycyclic aromatic hydrocarbon pollution remediation. The invention uses benzo [a] pyrene as a representative model of polycyclic aromatic hydrocarbons and sodium alginate beads as carriers to immobilize eight bacteria (erythrobacterium P1, flavus P2, Rhizobium P3, Mucilaginibacter P4, flavus P5, cuprous bacteria P6, cuprous bacteria P7 and cuprous bacteria P8). Sodium alginate beads containing eight bacteria are immobilized according to P1:P2:P3:P4:P6:P7:P8. The bacterial assemblage was obtained by mixing the mass ratio of 1:1:1:1:1:1:1:12:12:1. The invention adopts the method of immobilization and mixing to obtain the combined bacterial flora, avoiding the introduction of polycyclic aromatic hydrocarbons in the cultivation process and ensuring the proportion of each strain in the bacterial combination; adopts the sodium alginate embedding method to immobilize the bacteria, reduces the antagonistic effect among the strains in the combined bacterial flora, and improves the efficiency of the bacterial combination to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons.

【技术实现步骤摘要】
一种用于多环芳烃污染修复的海藻酸钠固定化组合菌群的制备方法
本专利技术涉及一种用于多环芳烃污染修复的海藻酸钠固定化组合菌群的制备方法，属于环境污染物生物处理

技术介绍
多环芳烃是一类广泛存在于环境中的持久性有机污染物，由两个或两个以上苯环以共有环边的形式形成，包括萘、菲、芘、苯并[a]芘等500多种化合物。在我国，苯并[a]芘也作为环境指标被纳入《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)、《环境空气质量标准》(GB3095-2012)以及《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB15618-2018)，苯并[a]蒽、苯并[a]芘等8种PAHs被纳入《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB36600-2018)，萘、菲等14种PAHs被纳入《展览会用地土壤环境质量评价标准(暂行)》(GB350-2017)。由于多环芳烃具有强烈的憎水性，生物可利用性低，且具有潜在的致畸、致癌、致突变效应，这些化合物很容易在土壤和沉积物中累积并通过食物链富集，从而严重危害环境中生物的生存繁殖和人类健康，因而其污染问题备受国际关注。由表1可知，我国多个河流流域与海域的沉积物均处于中度～高度的多环芳烃污染情况，珠江流域甚至出现高度～重度污染区域。表1国内外不同流域或海域沉积物中PAHs含量比较多环芳烃从环境中去除的方式包括光降解、燃烧、化学氧化以及生物降解等。微生物具有繁殖速度快、代谢方式多样、环境适应性强等特点，能够在不同类型的污染场地中生存，因而具有降解和转化有机污染物的巨大潜质。研究表明，由于多环芳烃具有憎水性强、挥发性弱、难降解的特点，微生物降解成为PAHs从环境中去除的最重要途径。微生物固定化技术是指利用物理或化学的方法，将游离的微生物或酶固定于一定载体的空间区域内，使微生物或酶保持活性并且能够反复利用的技术。现在具有高吸附性能的材料，可有效地吸附多环芳烃，使其由环境介质向固定化载体迁移，使固定化载体能够同时富集高浓度的降解菌和环境中的多环芳烃，增加多环芳烃与降解菌的接触，实现多环芳烃的富集-降解一体化，从而显著提高修复效果。目前多环芳烃污染修复中单菌种和菌群的使用较多。单菌种的筛选简单，但单菌种在实际环境中的适应能力较弱，容易退化；菌群对多环芳烃降解具有较好的效果，且抗逆性强，但为保证菌群中群落结构，培养过程中需要加入相应的污染物，容易造成二次污染。而组合菌群的结构较单菌种复杂，抗逆性更强，可适应环境条件的变化，且不会造成二次污染，在实际应用中具有巨大潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有固定化微生物降解多环芳烃存在的单菌株适应能力差、菌群容易造成二次污染的难题，提供一种安全、高效、稳定的用于多环芳烃污染修复的海藻酸钠固定化组合菌群。本专利技术为了实现上述目的，采用以下技术方案：本专利技术中的8种细菌(红细菌属P1、黄杆菌属P2、根瘤菌属P3、Mucilaginibacter属P4、黄杆菌属P5、贪铜菌属P6、贪铜菌属P7和贪铜菌属P8)由码头附近的沉积物中经苯并[a]芘-无机盐培养基选择性富集培养、分离纯化得到。在8个菌株中，P4能够在R2A液体培养基中生长良好，其余7个菌株能够在葡萄糖-无机盐液体培养基中生长良好。本专利技术中的8个菌株在固定化前预先经过培养成高浓度的菌液，具体培养步骤如下：将菌株P4接种于R2A液体培养基中，其余7个菌株接种于葡萄糖-无机盐液体培养基中，于28℃、160rpm的摇床中培养约48h后进行固定化。本专利技术中，在超净工作台中，向8个菌株的菌液中分别加入等体积的4％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌至菌液均匀，用无菌注射器吸取并逐滴注入4％CaCl2溶液中，静置5-10min进行硬化处理，捞出小球，用无菌生理盐水冲洗3次，装入磨口小瓶中，置于4℃冰箱中备用。此过程中，除菌液与无菌注射器外，其他用品在使用前均需于121℃高压灭菌30min。本专利技术中，将含有8个菌株的海藻酸钠小球按照菌株比例P1∶P2∶P3∶P4∶P5∶P6∶P7∶P8＝1∶1∶1∶1∶1∶12∶12∶1的质量比混合，得到优化群落结构的多环芳烃降解功能组合菌群。海藻酸钠固定化组合菌群处理14天后，水体中苯并[a]芘(初始浓度设为50mg/L)的去除率为73.79％，而加入灭菌的海藻酸钠小球的水体中苯并[a]芘的去除率为20.24％，对照组中苯并[a]芘的去除主要原因为海藻酸钠小球对苯并[a]芘的吸附作用。由此可见，海藻酸钠对苯并[a]芘具有吸附作用，可形成富集-降解一体化过程；海藻酸钠固定化的组合菌群对水体中苯并[a]芘的降解具有高效性。【附图说明】图1为不同比例的游离组合组对苯并[a]芘的降解效果；图2为游离组合菌群与海藻酸钠固定化组合菌群对苯并[a]芘的降解效果；图3为固定化原始菌群与组合菌群对苯并[a]芘的降解效果；图4为不同材料固定化组合菌群对苯并[a]芘的降解效果。图1中各曲线代表的意义为：-■-组合1，-●-组合2，-▲-组合3，--组合4，--对照组，无细菌添加。图2中横坐标各英文简称所代表的意义：free：游离组合菌群，immobilization：海藻酸钠固定化组合菌群。图3中横坐标各英文简称所代表的意义：Originalcommunity：原始群落，Consortia：海藻酸钠固定化组合菌群。图4中横坐标各英文简称所代表的意义：Z-control：未固定化细菌的沸石，Z：固定化组合菌群的沸石，S-control：未固定化细菌的海藻酸钠小球，S：固定化组合菌群的海藻酸钠小球，AC-control：未固定化细菌的活性炭，AC：固定化组合菌群的活性炭。【具体实施方式】本专利技术一种海藻酸钠包埋固定化组合菌群，通过采用海藻酸钠固定化8个菌株后混合，具体通过以下技术方案得到：采集码头附近的沉积物进行富集培养、分离纯化得到8种细菌(红细菌属P1、黄杆菌属P2、根瘤菌属P3、Mucilaginibacter属P4、黄杆菌属P5、贪铜菌属P6、贪铜菌属P7和贪铜菌属P8)。将菌株P4接种于R2A液体培养基中，其余7个菌株接种于葡萄糖-无机盐液体培养基中，于28℃、160rpm的摇床中培养约48h后进行固定化。在超净工作台中，向8个菌株的菌液中分别加入等体积的4％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌至菌液均匀，用无菌注射器吸取并逐滴注入4％CaCl2溶液中，静置5-10min进行硬化处理，捞出小球，用无菌生理盐水冲洗3次，装入磨口小瓶中，置于4℃冰箱中备用。此过程中，除菌液与无菌注射器外，其他用品在使用前均需于121℃高压灭菌30min。将含有8个菌株的海藻酸钠小球按照菌株比例P1∶P2∶P3∶P4∶P5∶P6∶P7∶P8＝1∶1∶1∶1∶1∶12∶12∶1的质量比混合，得到优化群落结构的多环芳烃降解功能组合菌群。本专利技术所使用的各种培养基如下：无机盐液体培养基：取5mL磷酸盐缓冲液、3.0mLMgSO4(22.Sg/L)、1.0mLFeCl3(0.25g/L)、1.0mLCaCl2(36.4g/L)、1.0mL微量元素溶液以及80mL沉积物提取液，定容至1L，pH7.2-7.4，121℃灭菌30min，备用。葡萄糖-无机盐液体培养基：往无机盐液体培养基中加入适量葡萄糖使葡萄糖浓度约为5g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻酸钠固定化的组合菌群，其特征在于采用海藻酸钠小球为载体固定化的组合菌群，其中所述的细菌包括贪铜菌属的3个菌株、黄杆菌属的2个菌株、红细菌属的一个菌株、根瘤菌属的一个菌株和Mucilaginibacter属的一个菌株。

【技术特征摘要】
1.一种海藻酸钠固定化的组合菌群，其特征在于采用海藻酸钠小球为载体固定化的组合菌群，其中所述的细菌包括贪铜菌属的3个菌株、黄杆菌属的2个菌株、红细菌属的一个菌株、根瘤菌属的一个菌株和Mucilaginibacter属的一个菌株。2.根据权利要求1所述的一种海藻酸钠包埋固定化的组合菌群，其特征在于所述的8个菌株均由码头附近沉积物中经富集培养、分离纯化得到。3.根据权利要求2所述的一种海藻酸钠固定化的组合菌群，其特征在于细菌固定化前经过培养制备成高浓度菌液(P4使用R2A液体培养基，其他7个菌株使用葡萄糖-无机盐液体培养基)，培养条件为28℃，160rpm。4.根据权利要求3所述的一种海藻酸钠固定化的组合菌群，其特征在于固定化菌株的海藻酸钠小球通过以下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家明，吴群河，麦顺之，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44