一种普利卡那肽的固相片段合成方法技术

本发明专利技术公开了一种普利卡那肽的固相片段合成方法，首先采用固相合成方法在固相树脂载体上并有缩合试剂的条件下由碳端向氮端逐一偶联保护氨基酸，合成得到八肽片段和八肽树脂，然后固相缩合得到十六肽树脂，根据十六肽树脂中R保护基特性选择R保护基的脱除与树脂裂解的同步或先后顺序，进行R保护基的脱除与树脂裂解；最后再依次定向环合两对二硫键，最终形成普利卡那肽粗肽，再经制备液相纯化、冻干得到高纯度普利卡那肽。本发明专利技术方法大大缩短了合成周期、避免了传统固相逐一偶联效率低的方法，也避开了步骤复杂、繁琐的液相方法，大大降低成本，其纯度高，副产物少，定向稳定、准确，有利于产品的纯化，产物收率高，便于大生产化操作。

A Solid Phase Fragment Synthesis Method of Plikanapeptide

The invention discloses a solid-phase fragment synthesis method of Plikana peptide. Firstly, octapeptide fragments and octapeptide resins are synthesized by coupling the protective amino acids from the carbon end to the nitrogen end one by one under the condition of solid-phase resin carrier and condensation reagent. Then, cetyl peptide resins are synthesized by solid-phase condensation, and the de-protection group of R is selected according to the characteristics of the protective group in cetyl peptide resins. In addition to the simultaneous or sequential decomposition of the resin, the R protective group was removed and the resin was decomposed. Finally, two pairs of disulfide bonds were directionally cyclized in turn to form the crude peptide of Plikana peptide, which was purified by liquid phase preparation and lyophilized to obtain high purity Plikana peptide. The method of the invention greatly shortens the synthesis period, avoids the traditional method of low solid-phase coupling efficiency one by one, and avoids the complicated and tedious liquid-phase method, greatly reduces the cost, has high purity, fewer by-products, stable and accurate orientation, and is conducive to the purification of products, high yield of products, and convenient for large-scale production operation.

【技术实现步骤摘要】
一种普利卡那肽的固相片段合成方法
本专利技术属于多肽类药物制备
，尤其涉及一种普利卡那肽的固相片段合成方法。
技术介绍
普利卡那肽，英文名：plecanatide，其结构如下：普利卡那肽(plecanatide)是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，含有十六个氨基酸的环状多肽，具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。目前普利卡那肽的化学合成方法如下：1)通过固相逐一偶联成十六全肽树脂再定向成环，如深圳翰宇CN103694320B、南京工业大学CN104628827A。其缺陷，周期长，偶联效率低。2)固相逐一偶联得到十六全肽树脂后，采用空气无序环化两对二硫键。如苏州科技大学CN107383170A。其缺陷，无序环化收率低、准确性差、杂质多且反应周期长。3)固相逐一偶联得到十六全肽树脂后，环化通过定向环化，四个Cys位置采用三个或四个不同保护基保护巯基，定向环化时要逐个去除保护基再进行固环。如苏州科技大学CN107383171A。其缺陷，半胱氨酸采用三或四个不同保护基保护使得工艺繁琐，引入杂质多且不利于产业化。4)固液结合法：通过片段6+8+2得到普利卡那肽全肽，液相合成6肽，固相合成得到8肽和2肽，再对接环化而成普利卡那肽。如WO2012/118972A2、CN108003222A。其缺陷，6片段肽液相合成强度大，三段片段肽的合成并对接使合成周期加长。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种普利卡那肽的固相片段合成方法，用以克服普利卡那肽固相逐一偶联过程中遇到偶联困难、疏水性强且偶联效率低的缺陷。为了实现上述目的，本专利技术技术方案如下：一种普利卡那肽的固相片段合成方法，所述普利卡那肽的固相片段合成方法，包括：采用八肽片段：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-OH；与八肽树脂：NH2-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R4)-Thr(R6)-Gly-Cys(R5)-Leu-树脂；在缩合剂的存在下固相缩合得到十六肽树脂：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R4)-Thr(R6)-Gly-Cys(R5)-Leu-树脂；根据十六肽树脂中R保护基特性选择R保护基的脱除与树脂裂解的同步或先后顺序，进行R保护基的脱除与树脂裂解；再依次定向环合两对二硫键，最终形成普利卡那肽粗肽，再经制备液相纯化、冻干得到高纯度普利卡那肽；其中：R选自Boc、Fmoc、Z中任意一个；R1选自Trt、Mtt中任意一个；R2选自tBu、OtBu、OAll中任意一个；R3选自OtBu、OAll、OBzl中任意一个；R4、R5选自Trt、Acm、StBu、Alloc中任意不同的一个；R6选自tBu、Bzl中任意一个。进一步地，所述八肽片段由以下步骤合成：采用固相合成方法，在固相树脂载体上并有缩合试剂的条件下由碳端向氮端逐一偶联保护氨基酸：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(R5)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(R3)-OH、Fmoc-Cys(R4)-OH、Fmoc-Glu(R3)-OH、Fmoc-Asp(R2)-OH、R-Asn(R1)-OH，得到：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-树脂；经裂解试剂脱除树脂，将反应液加入醚类溶剂中沉降得到八肽片段；所述裂解试剂为1％-50％的TFE/二氯甲烷溶液，反应时间为20分钟-2.0小时；温度为10-30℃，醚类溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚中任意一种，所述醚类溶剂的用量为4-6体积倍量。进一步地，所述八肽树脂由以下步骤合成：采用固相合成方法，在固相树脂载体上并有缩合试剂的条件下由碳端向氮端逐一偶联保护氨基酸：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(R5)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(R6)-OH、Fmoc-Cys(R4)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(R1)-OH，再脱除Fmoc保护基，得到NH2-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R4)-Thr(R6)-Gly-Cys(R5)-Leu-树脂。进一步地，所述的普利卡那肽序列中四个Cys侧链保护基团R4、R5保护基优选为Trt、ACM。进一步地，所述十六肽树脂，R保护基为Boc时，R保护基的脱除在树脂裂解反应中同步脱除；R保护基为Fmoc时，先脱除R保护基，再进行树脂裂解反应。进一步地，所述定向环合两对二硫键，包括：十六肽树脂经裂解试剂裂解反应后于醚类溶剂中沉降得到肽序列中含有一对Cys带Acm保护基团的线性肽；将所述线性肽溶解在含有机溶剂的水溶液中至澄清，加入氧化剂，环化反应得一环肽；将一环肽在过量的碘溶液中脱除另一对Cys上的侧链保护基Acm，同时环化得到普利卡那肽粗肽；所述裂解试剂为三氟乙酸、水、苯酚、苯甲醚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇中的任意2-4个组份组成，其中三氟乙酸占80％以上，其它组份各占1％-5％；裂解反应时间为0.5-3小时，温度为10-30℃，醚类溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚中的任意一种，优选4-6倍量(V/V)；所述含有机溶剂的水溶液为乙腈水溶液、乙醇水溶液、四氢呋喃水溶液、N,N-二甲基甲酰胺水溶液、二甲基亚砜水溶液中的任意一种，溶液浓度为5％-40％，所述的氧化剂为5％-30％的双氧水，氧化剂用量为肽用量的1-3摩尔倍量，反应时间为0.5-6小时；所述碘溶液用量为肽用量的2-5摩尔倍量，反应时间为1-6小时。进一步地，所述固相树脂为Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。进一步地，所述固相树脂替代度范围为0.1-1.6mmol/g。进一步地，所述八肽片段与八肽树脂固相缩合时采用的溶剂、所述保护氨基酸与固相树脂载体偶联反应中所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜中的任意一种，所用的保护氨基酸或八肽片段的用量为1-6摩尔倍量。进一步地，所用的缩合试剂为HOBt、HOAt、TBTU和DIC、DIEA的组合；反应时间为1-8h，温度为10-35℃。本专利技术提出的一种普利卡那肽的固相片段合成方法，通过片段(8+8)合成线性肽再两步定向环化，环化两对Cys巯基键，无须用脱除试剂刻意脱巯基保护基，可以脱除巯基保护基的同时或先后顺序并进行环化从而得到普利卡那肽的方法。本专利技术方法大大缩短了合成周期、避免了传统固相逐一偶联效率低的方法，也避开了步骤复杂、繁琐的液相方法，大大降低成本，其纯度高，副产物少，定向稳定、准确，有利于产品的纯化，产物收率高，便于大生产化操作。附图说明图1为本专利技术实施例八肽片段制作化学式；图2为本专利技术实施例八肽树脂制作化学式；图3为本专利技术实施例八肽片段制备过程中脱除树脂化学式；图4为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普利卡那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述普利卡那肽的固相片段合成方法，包括：采用八肽片段：R‑Asn(R1)‑Asp(R2)‑Glu(R3)‑Cys(R4)‑Glu(R3)‑Leu‑Cys(R5)‑Val‑OH；与八肽树脂：NH2‑Asn(R1)‑Val‑Ala‑Cys(R4)‑Thr(R6)‑Gly‑Cys(R5)‑Leu‑树脂；在缩合剂的存在下固相缩合得到十六肽树脂：R‑Asn(R1)‑Asp(R2)‑Glu(R3)‑Cys(R4)‑Glu(R3)‑Leu‑Cys(R5)‑Val‑Asn(R1)‑Val‑Ala‑Cys(R4)‑Thr(R6)‑Gly‑Cys(R5)‑Leu‑树脂；根据十六肽树脂中R保护基特性选择R保护基的脱除与树脂裂解的同步或先后顺序，进行R保护基的脱除与树脂裂解；再依次定向环合两对二硫键，最终形成普利卡那肽粗肽，再经制备液相纯化、冻干得到高纯度普利卡那肽；其中：R选自Boc、Fmoc、Z中任意一个；R1选自Trt、Mtt中任意一个；R2选自tBu、OtBu、OAll中任意一个；R3选自OtBu、OAll、OBzl中任意一个；R4、R5选自Trt、Acm、StBu、Alloc中任意不同的一个；R6选自tBu、Bzl中任意一个。...

【技术特征摘要】
1.一种普利卡那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述普利卡那肽的固相片段合成方法，包括：采用八肽片段：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-OH；与八肽树脂：NH2-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R4)-Thr(R6)-Gly-Cys(R5)-Leu-树脂；在缩合剂的存在下固相缩合得到十六肽树脂：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R4)-Thr(R6)-Gly-Cys(R5)-Leu-树脂；根据十六肽树脂中R保护基特性选择R保护基的脱除与树脂裂解的同步或先后顺序，进行R保护基的脱除与树脂裂解；再依次定向环合两对二硫键，最终形成普利卡那肽粗肽，再经制备液相纯化、冻干得到高纯度普利卡那肽；其中：R选自Boc、Fmoc、Z中任意一个；R1选自Trt、Mtt中任意一个；R2选自tBu、OtBu、OAll中任意一个；R3选自OtBu、OAll、OBzl中任意一个；R4、R5选自Trt、Acm、StBu、Alloc中任意不同的一个；R6选自tBu、Bzl中任意一个。2.如权利要求1所述的普利卡那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述八肽片段由以下步骤合成：采用固相合成方法，在固相树脂载体上并有缩合试剂的条件下由碳端向氮端逐一偶联保护氨基酸：Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(R5)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(R3)-OH、Fmoc-Cys(R4)-OH、Fmoc-Glu(R3)-OH、Fmoc-Asp(R2)-OH、R-Asn(R1)-OH，得到：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R3)-Cys(R4)-Glu(R3)-Leu-Cys(R5)-Val-树脂；经裂解试剂脱除树脂，将反应液加入醚类溶剂中沉降得到八肽片段；所述裂解试剂为1％-50％的TFE/二氯甲烷溶液，反应时间为20分钟-2.0小时；温度为10-30℃，醚类溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚中任意一种，所述醚类溶剂的用量为4-6体积倍量。3.如权利要求1所述的普利卡那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述八肽树脂由以下步骤合成：采用固相合成方法，在固相树脂载体上并有缩合试剂的条件下由碳端向氮端逐一偶联保护氨基酸：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(R5)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(R6)-OH、Fmoc-Cys(R4)-OH、Fmoc-Ala-O...

【专利技术属性】
技术研发人员：范小军，陶伟锋，陈鹏，朱志敏，章军杰，陈忠根，
申请(专利权)人：浙江苏泊尔制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33