一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，包括：步骤1)选取鸡血藤即将成熟种子，对其进行消毒，处理，将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养，即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，消毒包括：采用次氯酸钙的溶液清洗，再于温度70～80℃下处理20～30秒；步骤2)取嫩叶作为外植体，进行诱导培养，获得愈伤组织；步骤3)将愈伤组织进行继代培养至少二次，至其生长成为细胞团；步骤4)将细胞团进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系；步骤5)将悬浮细胞系进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系。步骤6)将鸡血藤悬浮细胞系收集细胞，纯净水提取3次，合并三次提取液，离心，将沉淀干燥后得到牛大力多糖。

A Cell Culture Method for Increasing the Yield of Polysaccharide from Herba Euphorbiae

The present invention discloses a cell culture method for increasing the yield of Polysaccharide from Bovine vigorously. The method includes: step 1) selecting the imminent mature seeds of Caulis Caulis, sterilizing them, treating them, and putting them in the germinating liquid medium for germination culture. The mature seeds are the seeds of Caulis Caulis Caulis Hypochlorite plants 90-130 days after flowering, and sterilizing them include: cleaning them with calcium hypochlorite solution and then warming them. Steps 2) Take tender leaves as explants and induce them to obtain callus; Steps 3) Subculture the callus at least twice until it grows into cell clusters; Steps 4) Suspension start-up culture of cell clusters to obtain suspension cell lines; Steps 5) Proliferation culture of suspension cell lines to obtain suspension cell lines of Caulis sinensis. Step 6) Cells were collected from the suspension cell line of Caulis Caulis, purified water was extracted three times, combined with three times of extract, centrifuged, and then dried by precipitation to obtain Polysaccharide from Caulis vigorously.

【技术实现步骤摘要】
一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法
本专利技术涉及中药材栽培
，尤其涉及一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法。
技术介绍
鸡血藤，中药名。为豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤茎。秋、冬二季采收，除去枝叶，切片，晒干。分布于广东、广西、云南等地。具有活血补血，调经止痛，舒筋活络之功效。用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。随着研究的深入，科学家发现，鸡血藤的根部，牛大力富含多糖等多种物质，具有明显的抗肿瘤作用，在医学上的需求量越来越大。野生鸡血藤植株的产量已经不能满足市场需求。为满足对该中药材的需求，近年来，逐渐采用人工栽培及组织培养的方式对鸡血藤进行培养。组织培养由于具有培养时间短、不占用耕地等优点，逐渐快速发展起来。然而，在组织培养中，由于培养时间较短，因此鸡血藤悬浮细胞中多糖等物质的含量较野生型少。如何在较短的时间内使得培养的鸡血藤悬浮细胞中含有较多量的多糖，是目前正在积极探究的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，包括：一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，包括：步骤1)首先选取鸡血藤即将成熟种子，然后对即将成熟种子进行消毒，再于温度0～2℃下处理24～48h，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度1～5g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度70～80℃下处理20～30秒，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA0.2～0.6mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液。步骤6)将所述鸡血藤悬浮细胞系以转速2000～3000rpm、温度0～4℃下离心3～5分钟收集细胞，然后于恒温水浴90～100℃下，分别用纯净水提取3次，第一次提取用的纯净水用量与细胞的干重的比例为10:1，第一次提取时间为40min，第二次提取用的纯净水用流量与细胞的干重的比例为5:1，第二次提取时间为10min，第三次提取用的纯净水于细胞的干重的比例为2:1，第三次提取时间为5min，合并三次提取液，之后向其中加入体积百分比75％的乙醇，以转速6000～8000rpm、温度0～4℃下离心3～5min后弃去废液，将沉淀干燥后得到牛大力多糖。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤1)中，所述即将成熟种子为开花后110天的鸡血藤植株的种子。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤1)中，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度3g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度75℃下处理25秒。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤1)中，所述萌发液体培养基包含：1/43MS、蔗糖11g/L和6-BA0.2mg/L。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤4)中，所述悬浮启动培养的接种量为3～5g/L继代培养产物。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤5)中，所述增殖培养的接种量比例为：取占所述增殖液体培养基10％～20％的悬浮启动培养后的培养物。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，所述银杏叶汁液的获取方法为：取银杏叶片按照质量比10:1加入水，之后粉碎，并以200目过滤筛过滤，得到滤液即为银杏叶汁液。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤1)中，所述萌发培养的培养条件为：光照强度800～1500lux，光周期8～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为7～15天。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤2)中，所述诱导培养的培养条件为：光照强度1500～3000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为20～40天。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤3)中，每次所述继代培养的培养条件为：光照强度2000～4000lux，光周期10～12小时/日，培养温度为24～28℃，培养时间为4～8天。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤4)中，所述悬浮启动培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～120rpm转速震荡培养，培养时间为2～3天。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤5)中，所述增殖培养的培养条件为：暗培养，培养温度为24～28℃，100～200rpm转速震荡培养，培养时间为7～15天。优选的是，所述的提高牛大力多糖产量的细胞培养方法中，步骤1)中，所述萌发液体培养基上方放置有一滤纸，所述即将成熟种子分布于所述滤纸上。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术提供一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，包括：步骤1)首先选取鸡血藤即将成熟种子，然后对即将成熟种子进行消毒，再于温度0～2℃下处理24～48h，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度1～5g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度70～80℃下处理20～30秒，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；本专利技术首先选取即将成熟种子，对其进行消毒，以避免产生细菌污染后期培养过程，并且，本专利技术的消毒采用次氯酸钙和低温瞬时灭菌，在对种子进行消毒的同时，也能对其萌发进行刺激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，其特征在于，包括：步骤1)首先选取鸡血藤即将成熟种子，然后对即将成熟种子进行消毒，再于温度0～2℃下处理24～48h，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度1～5g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度70～80℃下处理20～30秒，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6‑BA 0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6‑BA 0.2～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6‑BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6‑BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6‑BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤6)将所述鸡血藤悬浮细胞系以转速2000～3000rpm、温度0～4℃下离心3～5分钟收集细胞，然后于恒温水浴90～100℃下，分别用纯净水提取3次，第一次提取用的纯净水用量与细胞的干重的比例为10:1，第一次提取时间为40min，第二次提取用的纯净水用流量与细胞的干重的比例为5:1，第二次提取时间为10min，第三次提取用的纯净水于细胞的干重的比例为2:1，第三次提取时间为5min，合并三次提取液，之后向其中加入体积百分比75％的乙醇，以转速6000～8000rpm、温度0～4℃下离心3～5min后弃去废液，将沉淀干燥后得到牛大力多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种提高牛大力多糖产量的细胞培养方法，其特征在于，包括：步骤1)首先选取鸡血藤即将成熟种子，然后对即将成熟种子进行消毒，再于温度0～2℃下处理24～48h，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度1～5g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度70～80℃下处理20～30秒，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8；步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6-BA0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6-BA0.2～0.6mg/L，NAA0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6-BA0.5～1mg/L，NAA0.02～0....

【专利技术属性】
技术研发人员：梁伟艺，钟静海，
申请(专利权)人：梁伟艺，
类型：发明
国别省市：广西,45