本发明专利技术涉及一种对顺铂耐药的循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体以及所述核酸适体修饰的磁珠。本发明专利技术所述核酸适体或磁珠与现有技术已知的其它核酸适体或磁珠组合使用可提高循环肿瘤细胞的捕获效率，进一步利用微孔芯片二次纯化可提高循环肿瘤细胞的纯度，满足基因分析的要求。还特别提供了一种高效捕获耐药异质性非小细胞肺癌循环肿瘤细胞、进行基因分析的方法及试剂。
【技术实现步骤摘要】
一种耐药异质性循环肿瘤细胞捕获与基因分析的试剂、装置和方法
本专利技术涉及生物检测领域，特别一种基于微孔芯片的核酸适体修饰的磁珠组合及其用于耐药异质性循环肿瘤细胞的捕获与基因分析的方法。
技术介绍
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。其中，非小细胞肺癌分为鳞癌，腺癌和大细胞癌,占肺癌总数比例的85％。目前，非小细胞肺癌的治疗方法主要是手术切除，化疗和放疗。由于肿瘤容易复发和转移，采取治疗手段后实时监测肿瘤进程，才能及时修改治疗方案，有效提高患者的生存率。循环肿瘤细胞是从肿瘤原发病灶或转移灶中脱落并进入血液循环系统的肿瘤细胞。通过计数外周血中循环肿瘤细胞的数目可以实时监测癌症的发展进程，评估患者的预后，尤其适用于手术切除肿瘤病灶的患者无法提供病理切片的情况。但是，循环肿瘤细胞的数目是非常稀少的，1mL血液中仅仅有1-10个循环肿瘤细胞，同时，白细胞的数目为106-107左右。另外，循环肿瘤细胞存在异质性，造成不同患者，同一患者不同部位的肿瘤细胞，甚至同一部位不同肿瘤细胞之间的大小，蛋白表达量等均有不同。同时，肿瘤细胞异质性也是细胞产生耐药性的主要原因之一，还有可能导致化疗后肿瘤细胞产生基因突变。此时，仅仅依靠计数无法获得有关基因层面更详细的信息，也就无法确定如何进行针对性的治疗。虽然，循环肿瘤细胞单细胞基因分析为全面准确地获得肿瘤“实时切片”提供了机会。然而，在不受白细胞干扰的前提下，从病人血样中获得完整的异质性循环肿瘤细胞，并进行基因层面的分析仍是挑战。目前，核酸适体或抗体结合纳米颗粒、微流芯片或者纳米结构基底等策略已被大量用于循环肿瘤细胞的分离和表征。但是，由于已有的大部分方法忽略了循环肿瘤细胞的异质性，仅采用一种抗体对循环肿瘤细胞进行捕获，造成了循环肿瘤细胞的损失，也使后续的基因分析存在一定的片面性。虽然有少数报道将多种抗体用于识别，但由于抗体高成本，靶标范围受限和合成复杂等缺点，使得这些方法无法进行大范围的临床普及。核酸适体是经指数富集配体系统进化技术筛选出的能特异性结合细胞、细菌、蛋白质或其他小分子的寡聚核苷酸片段。与抗体相比，核酸适体更加容易合成和保存，并且对靶标有很强的特异性，被称为“化学抗体”。通过将核酸适体连接在磁珠上，可以实现对循环肿瘤细胞的捕获，同时易于分离，并且保证了细胞的完整性，方便实现后续的基因分析。虽然，已有一些研究采用核酸适体修饰的磁珠对循环肿瘤细胞进行捕获，但在这些方法中均未实现对异质性循环肿瘤细胞的捕获。另外，目前还未见报道针对耐药异质性循环肿瘤细胞的捕获。除此之外，由于血液组分的复杂性，已有的基于核酸适体修饰磁珠的捕获方法都不可避免的受到白细胞的干扰而未能实现从病人血样中捕获循环肿瘤细胞进行单细胞水平的基因分析。因此，开发高效的对异质性循环肿瘤细胞的分离分析技术仍需进一步的探索。
技术实现思路
为解决上述问题，一种对顺铂耐药的循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体以及所述核酸适体修饰的磁珠。本专利技术所述核酸适体或磁珠与现有技术已知的其它核酸适体或磁珠组合使用可提高循环肿瘤细胞的捕获效率，进一步利用微孔芯片二次纯化可提高循环肿瘤细胞的纯度，满足基因分析的要求。还特别提供了一种高效捕获耐药异质性非小细胞肺癌循环肿瘤细胞、进行基因分析的方法及试剂。利用本专利技术中的核酸适体修饰的磁珠组合可以捕获耐药异质性非小细胞肺癌的循环肿瘤细胞，并通过外加磁场进行分离，后通过CK和CD45抗体染色，分别标记循环肿瘤细胞和非特异性捕获下来的白细胞，然后将分离得到的细胞放置在微孔芯片上进行二次纯化，在荧光显微镜下寻找到含有循环肿瘤细胞的微孔，利用显微操作将循环肿瘤细胞从微孔中取出，并完成基因突变等方面的基因分析。利用本专利技术提出的方法，可实现非小细胞肺癌患者在化疗耐药后的循环肿瘤细胞高效捕获和基因分析。一方面，本专利技术提供一种与顺铂耐药的循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体，其特征在于所述核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。第二方面，本专利技术提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠，其特征在于所述磁珠连接有本专利技术所述核酸适体ap2。本专利技术所述磁珠，其中通过核酸适体上标记的生物素与磁珠表面标记的链霉亲和素之间的相互结合实现核酸适体与磁珠的连接，优选磁珠的直径为200±30nm。第三方面，本专利技术提供一种核酸适体组，其至少包含两种核酸适体，其中至少一种核酸适体与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力，并且至少一种核酸适体与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力。本专利技术所述核酸适体组，其中所述与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术所述核酸适体组，其中所述与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap1，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。第四方面，本专利技术提供一种磁珠组，其特征在于至少包含两种磁珠，其中至少一种磁珠连接有与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体，并且至少一种磁珠连接有与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体。本专利技术所述磁珠组，其中连接到磁珠上与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术所述磁珠组，其中连接到磁珠上与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap1，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术所述磁珠，其中通过核酸适体上标记的生物素与磁珠表面标记的链霉亲和素之间的相互结合实现核酸适体与磁珠的连接，优选磁珠的直径为200±30nm。第五方面，本专利技术提供一种核酸适体的衍生物，其可替代本专利技术所述核酸适体用于核酸适体组、磁珠、磁珠组。所述核酸适体衍生物是将所述核酸适体进行如下修饰或改造得到的：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。第六方面，本专利技术提供一种循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其包含本专利技术所述核酸适体、磁珠、核酸适体组、磁珠组。本专利技术所述循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其特征在于还包括用于对循环肿瘤细胞进行二次纯化的微孔芯片。本专利技术所述循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其特征在于所述微孔芯片是以硅片为模板，由聚二甲基硅氧烷材料制成；每cm2微孔芯片上以55×55的方式均匀排列着3025个圆柱形微孔，每个微孔深200μm、直径150μm，并与相邻微孔间隔30μm。本专利技术所述循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其特征在于还包括对特定位点进行扩增及测序分析的试剂。本专利技术所述循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其特征在于所述进行扩增及测序分析的位点包括KRAS位点、EGFR位点。本专利技术所述循环肿瘤细胞捕获试剂盒，其特征在于对特定位点进行扩增的试剂包括SEQIDNO:3-4、SEQIDNO:5-6、和/或SEQIDNO:7-8。第七方面，本专利技术还提供一种利用本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与顺铂耐药的循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体，其特征在于所述核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种与顺铂耐药的循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体，其特征在于所述核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。2.一种用于循环肿瘤细胞捕获的磁珠，其特征在于所述磁珠连接有如权利要求1所述的核酸适体。3.一种核酸适体组，其至少包含两种核酸适体，其中至少一种核酸适体与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力，并且至少一种核酸适体与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力；其中所述与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。4.一种磁珠组，其特征在于至少包含两种磁珠，其中至少一种磁珠连接有与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体，并且至少一种磁珠连接有与非耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体；其中所述与顺铂耐药循环肿瘤细胞具有高亲和力的核酸适体为ap2，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。5.如权利要求1-4任一中的核酸适体，其特征在于：将所述核酸适体进行如下修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。d)将核酸适体改造为肽核酸，得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：方晓红，董再再，赵立波，张振，徐丽，周卫，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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