一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法。所述方法为：先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成蛋白‑脂质复合物，然后将蛋白‑脂质复合物采用与水互溶的有机溶剂稀释后再通过快速纳米沉淀方法制备得到蛋白纳米颗粒。与传统的蛋白纳米颗粒制备方法相比，本发明专利技术最大优势就是可连续大规模化生产，生产力可达1.2 g/h，远高于传统的蛋白颗粒制备方法的生产能力。另外快速纳米沉淀方法可连续化生产，批次间的差异小，适用于工业化生产。进一步地，本发明专利技术所制备的蛋白颗粒的表面包裹的透明质酸可赋予蛋白药物纳米颗粒可长期储存的稳定性和粘液穿透性。本发明专利技术所述方法制得的蛋白纳米颗粒在蛋白药物的体内输送方面具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法
本专利技术属于生物医药领域，更具体地，涉及一种蛋白纳米颗粒的高通量制备方法。
技术介绍
生物技术药物主要包括多肽类药物、蛋白质类药物和核酸类药物。但目前为止，生物药物多为蛋白多肽类，在已上市和开发的生物技术药物中，蛋白质类药物占了绝大多数，主要包括细胞因子药物和重组激素类药物等。目前，蛋白多肽类药物因为其高特异性和优秀的疗效在肿瘤、自身免疫缺陷疾病及心血管病等疾病中有着不可替代的作用。但是，与常规药物相比，蛋白多肽类药物因为分子量大，稳定性差，易变性，在体内的半衰期短，难以穿透肠道黏膜，限制了其广泛应用。近些年来，脂质体、胶束和水凝胶等载体均有被开发用于蛋白多肽类药物的体内输送，但是这些输送体系往往受限于其低的药物包封率和复杂的制备过程，难以规模化生产和临床转化。快速纳米沉淀是一种可以通过动力学控制分子聚集过程制备药物纳米颗粒的微流控技术。并且该方法可连续大规模化生产，适合工业化生产。它的主要机制是依靠高湍流混合器装置（例如，同轴湍流混合器，四通道涡流混合器等）实现溶剂（含药物）与非溶剂（含稳定剂）的快速交换，通过调控溶质成核与增长速率控制纳米颗粒的粒径及分散性。并且已经有药物纳米颗粒用该方法得以大规模生产制备。但是快速纳米沉淀方法的一个局限性就是其只适用于疏水性的小分子药物，而不适用于蛋白多肽类等生物技术药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的缺陷和不足，提供一种蛋白纳米颗粒的高通量制备方法。本专利技术所述方法通过结合疏水离子对技术和快速纳米沉淀方法，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成油溶性的蛋白-脂质复合物，然后再快速纳米沉淀方法制备成蛋白纳米颗粒，所述方法对于蛋白药物的作用效果无任何不良影响，可大规模制备得到载药量高，且粒径可控、分散窄、稳定性好、毒副作用小的蛋白纳米颗粒。本专利技术的另一目的在于提供一种治疗性蛋白纳米颗粒的冻干制剂。本专利技术的上述目的是通过以下方案予以实现的：一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成蛋白-脂质复合物，然后将蛋白-脂质复合物采用与水互溶的有机溶剂稀释后再通过快速纳米沉淀方法制备得到蛋白纳米颗粒。优选地，所述疏水离子对方法的过程包括：将蛋白的水溶液和与蛋白带相反电荷的脂质的二氯甲烷或三氯甲烷溶液等体积混合，其中蛋白和正电脂质的质量比为1:1～8，加入与水互溶的有机溶剂形成均相溶液，再加入与蛋白水溶液等体积的水离心、分层，所得下层有机相即为溶有蛋白-脂质复合物的溶液。在配置蛋白水溶液时，为了便于蛋白的溶解，可采用稀酸溶液溶解蛋白，然后用碱将溶液调制中性。优选地，蛋白的水溶液和脂质溶液混合后，其中蛋白和脂质的质量比为1:4～8。在蛋白和脂质的质量比在比例范围内时，在萃取时，蛋白药物从水相中转移到有机相中的转移率很高，均超过了97%，即在制备过程中，蛋白药物的利用率更高。优选地，所述与水互溶的有机溶剂为乙醇。优选地，所述快速纳米沉淀方法的过程包括：将经过疏水离子对方法制得的蛋白-脂质复合物溶液用乙醇按照体积比为1:5～11稀释后和浓度为0.5～10mM的磷酸盐缓冲液按体积比1:3～9分别引入涡流混合器中的不同通道，其中有机相流速为1mL/min～10mL/min，通过高速湍流混合制备得到蛋白纳米颗粒溶液。在快速纳米沉淀过程中，蛋白-脂质复合物的稀释比例、磷酸盐缓冲液中溶质的浓度，以及蛋白-脂质复合物的乙醇溶液和磷酸盐缓冲液的比例均会影响蛋白纳米颗粒的粒径大小，只有当上述3个条件或参数在上述范围内时，才能制备得到粒径大小合适、粒径均一度高的蛋白纳米颗粒。优选地，磷酸盐缓冲液中溶质的浓度为0.5～1mM；在涡流混合器中中，有机溶液和水相的体积比分别为1:7，有机相流速为5mL/min。在此条件下时，所制备的蛋白纳米颗粒的重复性和均一性最佳，其粒径大小也更好，平均粒径为35nm。优选地，所述蛋白纳米颗粒溶液和负电聚合物水溶液分别引入涡流混合器的不同通道，即可制备得到负电聚合物稳定涂覆的蛋白纳米颗粒；其中蛋白纳米颗粒溶液的流速为1mL/min～40mL/min，负电聚合物的流速为0.1mg/mL～0.5mg/mL。优选地，所述蛋白药物为胰岛素、卵清蛋白或人血清蛋白。更优选地，所述蛋白药物为胰岛素。优选地，所述脂质为DDAB或DOTAP。优选地，所述负电聚合物包括但不限于透明质酸，海藻酸钠或聚谷氨酸。本专利技术同时还保护一种包含上述方法制备的蛋白纳米颗粒的冻干制剂。优选地，所述蛋白纳米颗粒溶液中加入冻干保护剂，经冷冻、干燥即可得到所述冻干制剂。优选地，所述冻干保护剂为甘露醇、木糖醇、甘氨酸或山梨醇中的一种或多种。更优选地，所述冻干保护剂为甘露醇和木糖醇的混合物。优选地，所述甘露醇质量、木糖醇质量和蛋白纳米颗粒溶液体积的比例为0～10g:0～10g:100mL。更优选地，所述甘露醇质量、木糖醇质量和蛋白纳米颗粒溶液体积的比例为0.5g:1g:100mL。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：与传统的蛋白纳米颗粒制备方法相比，本专利技术最大优势就是可连续大规模化生产，生产力可达1.2g/h，远高于传统的蛋白颗粒制备方法的生产能力。另外快速纳米沉淀方法可连续化生产，批次间的差异小，适用于工业化生产。进一步地，本专利技术所制备的蛋白颗粒的表面包裹的透明质酸可赋予蛋白药物纳米颗粒可长期储存的稳定性和粘液穿透性。本专利技术所述方法制得的蛋白纳米颗粒在蛋白药物的体内输送方面具有较大的应用前景。附图说明图1为胰岛素和DDAB之间的比例对胰岛素的相转移率的影响。图2（a）游离胰岛素在水中和insulin-DDAB在有机溶剂中的粒径图，（b）游离胰岛素和insulin-DDAB疏水离子对复合物的圆二色谱。图3为磷酸盐缓冲液盐浓度对胰岛素纳米颗粒粒径的影响。图4为胰岛素纳米粒制备的批次间差异性。图5为流速对在胰岛素纳米粒表面涂覆HA的影响。图6为胰岛素纳米冻干制剂的体内降血糖效果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1以胰岛素为蛋白药物为例，制备胰岛素纳米颗粒，具体的方法如下：（1）疏水离子对过程①称取胰岛素(insulin)溶于0.01M的稀盐酸溶液中，配成5mg/mL的胰岛素溶液，用NaOH调节溶液pH至7.4备用；②称取DDAB溶于二氯甲烷，配成一系列的DDAB有机溶液(质量浓度为5mg/mL～40mg/mL)；③等体积的胰岛素溶液和DDAB二氯甲烷溶液（均为(5mL)）混合后，加入双倍体积(10mL)的乙醇形成单相溶液，100rpm轻微震荡30分钟后加入5mL纯水重新分相，离心后，下层有机相即为溶有胰岛素-脂质（insulin-DDAB）复合物的溶液。通过检测上清中胰岛素的含量，计算胰岛素从水相到有机相中的相转移率。测得结果如图1所示，从图中可知，当DDAB和insulin的质量比从1:1增大到4：1时，其相转移率为从38.8%逐渐增大至97.2%，继续增大DDAB和insulin的质量比，相转移率逐渐接近本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，其特征在于，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成蛋白‑脂质复合物，然后将蛋白‑脂质复合物采用与水互溶的有机溶剂稀释后再通过快速纳米沉淀方法制备得到蛋白纳米颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，其特征在于，先利用疏水离子对方法将亲水的蛋白药物转换成蛋白-脂质复合物，然后将蛋白-脂质复合物采用与水互溶的有机溶剂稀释后再通过快速纳米沉淀方法制备得到蛋白纳米颗粒。2.根据权利要求1所述治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，其特征在于，所述疏水离子对方法的过程包括：将蛋白的水溶液与蛋白带相反电荷的脂质的二氯甲烷或三氯甲烷溶液等体积混合，其中蛋白和脂质的质量比为1:1～8，加入与水互溶的有机溶剂形成均相溶液，再加入与蛋白水溶液等体积的水离心、分层，所得下层有机相即为溶有蛋白-脂质复合物的溶液。3.根据权利要求2所述治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，其特征在于，蛋白的水溶液和脂质溶液混合后，其中蛋白和脂质的质量比为1:4～8。4.根据权利要求1所述治疗性蛋白纳米颗粒的高通量制备方法，其特征在于，所述快速纳米沉淀方法的过程包括：将经过疏水离子对方法制得的蛋白-脂质复合物溶液用乙醇按照体积比为1:5～11稀释后和浓度为0.5～10mM的磷酸盐缓冲液按体积比1:3～9分别引入涡流混合器中的不同通道，其中有机相流速为1mL/min～10mL/min，通过高速湍流混合制备得到蛋白纳米颗粒溶液。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾志鹏，陈永明，高虓虎，刘利新，赵鹏飞，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44