一种磁性复合微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种磁性复合微球及其制备方法及应用，具体涉及一种具有可调聚合物壳层磁性复合微球的合成对菠萝蛋白酶的分离纯化及酶性能研究，属于天然产物分离纯化技术领域；本发明专利技术首先制备Fe3O4@SiO2并修饰双键，再通过蒸馏沉淀聚合反应合成了Fe3O4@SiO2@P(NIPAM‑co‑AIM)微球，鳌合Ni

【技术实现步骤摘要】
一种磁性复合微球及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种磁性复合微球及其制备方法及应用，具体涉及一种具有可调聚合物壳层磁性复合微球的合成对菠萝蛋白酶的分离纯化及酶性能研究，属于天然产物分离纯化

技术介绍
菠萝蛋白酶，亦称为凤梨酵素，是从菠萝的果茎，叶，皮中提取出来，应用于各个行业，用于食品加工，烘焙，肉类的嫩化。在美容行业中，具有嫩肤，美白祛斑的优异功效。在医药行业，科学家们已经开展了药理学研究调查，证明菠萝蛋白酶可以抑制血小板聚集，治疗心血管疾病，阻碍肿瘤细胞的增殖。该酶对肿胀和炎症也有效。由于这些宝贵的特性，工业上菠萝蛋白酶的提取方法主要工艺有高岭土吸附法、单宁沉淀法、盐析法和超滤法等高岭土吸附法，凝胶过滤法和水相两相萃取法。但这些方法都各自存在一些不足之处，如工艺流程长，原料消耗多，成本高，酶活总回收率低。而且，这些方法通常需要存在有机化学试剂溶剂和高温，这可能导致靶蛋白的构象发生变化，从而变质。因此，迫切的需要开发出更高效，生物相容性好的提取菠萝蛋白酶技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前菠萝蛋白酶提取工艺复杂，酶活损失严重，污染环境等缺陷，而提供一种新型的功能性聚合物壳的核/壳磁性复合微球分离纯化菠萝蛋白酶的新方法，该方法具有操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，生产成本低等优点，且磁性微球可循环使用。本专利技术采取的技术手段如下：本专利技术首先提供一种新型的功能性聚合物壳的核/壳磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+的制备方法，具体步骤如下：（1）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（N-异丙基丙烯酰-合-N-烯丙基咪唑）（Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)）微球的合成：称量Fe3O4粉末添加至含无水乙醇、蒸馏水中和氨水的混合溶液中，并进行超声分散，于室温条件下开启机械搅拌，使用移液枪向反应体系中逐滴加入正硅酸四乙酯（TEOS），机械搅拌过夜，利用磁铁分离得到产物二氧化硅包覆四氧化三铁磁性微球（Fe3O4@SiO2），并利用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。Fe3O4@SiO2表面修饰双键：利用硅烷偶联剂MPS在醇水混合溶液中的水解作用可在Fe3O4微球表面形成丰富的双键。具体操作步骤为：将0.1-0.5gFe3O4@SiO2利用超声分布于含有30-50mL乙醇，5-15mL水，1-2mL氨水和0.3-0.9gMPS的混合溶液中，在70℃条件下机械搅拌24h。利用磁铁分离产物，并使用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。称量表面修饰双键的Fe3O4@SiO20.03-0.08g超声分散于30-50mL乙腈中，然后加入共聚单体N-烯丙基咪唑（AIM）和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，按照NIPAM和AIM的质量比为1-9:9-1的比例合成，分别加入60-180mg交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和4-8mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）引发反应。将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度在30min内由室温均匀升至乙腈沸点，大约一个小时蒸馏出一半溶剂时，反应终止。将得到的产物依次用乙醇和去离子水多次清洗后，进行干燥至恒重。（2）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（N-异丙基丙烯酰-合-N-烯丙基咪唑）合镍（Ⅱ）（Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+）的合成：将40-60mg步骤（1）得到的Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)微球分散于8-12mL浓度为0.1M的NiCl2溶液中，机械搅拌反应；磁分离产物，用乙醇和水洗涤几遍；在干燥至恒重；后将所得产物分散于NiCl2溶液中，室温搅拌2h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。本专利技术还提供该新型磁性微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+用于分离纯化菠萝蛋白酶，并实现对菠萝蛋白酶的热保护作用，具体内容如下：将浓度为0.1-1.0mg/mL的菠萝蛋白酶溶液与0.1-0.3mgFe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+微球混合，用浓度为0-1.5M的NaCl调节pH为4-8，在15℃到40℃的恒温震荡箱内震荡10分钟-50分钟，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值。本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术中，在Fe3O4表面包覆SiO2可以有效避免Fe3O4之间的磁性偶极相互作用造成的聚集现象，并且外界环境中的酸不易侵蚀到内部的Fe3O4，提高了其生物相容性，并且包覆SiO2后，其粒子表面的硅羟基含量也进一步得到提高，有利于各种聚合物的进一步修饰。引入1-乙烯基咪唑单体作为螯合金属离子的连接臂，可在磁性微球表面形成高密度连续壳层，增加了材料对菠萝蛋白酶的吸附量。（2）本专利技术中所设计合成的可调聚合物壳层磁性微球由于Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+中NIPAM对温度的特殊敏感性，可作为对酶热保护的响应型开关，将达到吸附平衡的Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+与菠萝蛋白酶的混合液，分别置于25,55,60,65,70,75,80℃的环境中保持10min，后将吸附剂上的菠萝蛋白酶洗脱下来测酶活，对照组与上述操作一样，结果见图6，以室温下的酶活为基准，可以发现，游离菠萝蛋白酶在80℃时酶活几乎完全损失，而在有吸附剂材料存在时，酶活性比游离酶高，由于菠萝蛋白酶的最适温度是55℃，所以在55℃条件下变性10min后，酶的活性损失并不多，但随着变性温度的增加，结合酶的活性明显高于游离酶，表明Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+对菠萝蛋白酶有一定的热保护作用。（3）本专利技术中制备合成的Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+该材料具有很好的重复利用性，在循环使用6次后，菠萝蛋白酶的吸附量仍然能够保持为原来的90%；此外，将吸附剂材料的每一次循环利用后的洗脱液保留，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，从电泳图中可以直观的看出材料能够实现循环利用，有助于其进一步的工业应用。（4）与现有的分离纯化菠萝蛋白酶技术相比较，本专利技术中使用的分离纯化方法操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，且对环境无污染。另外，从菠萝皮、菠萝茎等部分提取菠萝蛋白酶不但可以改善环境，同时也提高了菠萝产业的增值，实现了废弃资源的重新利用，将产生良好的经济和社会效益。附图说明图1为按照实施例1和实施例3制备的Fe3O4（a）和Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)（b）的TEM图。图2为按实施例1和实施例3制得的Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）和Fe3O4@p(GMA-co-NIPAM)（c）的红外谱图。图3为按实施例1和实施例3制得的Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）,Fe3O4@SiO2/MPS(c),Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)(d),Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+(e)的VSM图。图4为实施例6中的Fe3O4@SiO2@本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM‑co‑AIM)/Ni2+，其特征在于，所述复合微球呈双层壳式结构，具有超顺磁性，能用于菠萝蛋白酶的分离纯化。

【技术特征摘要】
1.一种磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+，其特征在于，所述复合微球呈双层壳式结构，具有超顺磁性，能用于菠萝蛋白酶的分离纯化。2.一种磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（N-异丙基丙烯酰-合-N-烯丙基咪唑）（Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)）微球的合成：称量表面修饰双键的Fe3O4@SiO2超声分散于乙腈中，然后加入共聚单体N-烯丙基咪唑和N-异丙基丙烯酰胺混匀，再分别加入交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺和引发剂偶氮二异丁腈引发反应；将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度由室温均匀升至乙腈沸点，蒸馏出一半溶剂时，反应终止；将得到的产物用乙醇和去离子水清洗后，干燥至恒重；（2）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（N-异丙基丙烯酰-合-N-烯丙基咪唑）合镍（Ⅱ）（Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+）的合成：将步骤（1）得到的Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)微球分散于NiCl2溶液中，机械搅拌反应；磁分离产物，用乙醇和水洗涤后干燥至恒重；将所得产物分散于NiCl2溶液中，搅拌均匀后磁分离产物，用去离子水洗涤，真空干燥至恒重。3.根据权利要求2所述的一种磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-co-AIM)/Ni2+的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的Fe3O4@SiO2和乙腈的用量比例为0.03-0.08g：30-50mL。4.根据权利要求2所述的一种磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(NIPAM-c...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢又元，王楠，张锦燕，韩娟，王赟，李春梅，王蕾，毛艳丽，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32