双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用制造技术

双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用，双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附制备。通过十六烷基三甲基氯化铵为模板剂，三乙醇胺为pH调节剂，正硅酸乙酯为硅源，在一定的温度与时间下，合成了具有较小尺寸而较大孔径的介孔二氧化硅纳米粒。在介孔二氧化硅表面进行基团修饰，并与树状高分子聚合物组装，制备得到了双重载药的复合纳米载体。所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体可在协同高效地用于Bcl‑2靶点丰富的治疗癌症药物中应用，也可用于在制备克服耐药性癌症的治疗药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备与应用
本专利技术涉及双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，尤其是涉及双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备方法与应用。
技术介绍
Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡途径中的一种重要的蛋白，Bcl-2家族蛋白有20多种，它们至少拥有四个Bcl-2同源结构域中的一种，目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1/Bfl-1等，而另一类具有促凋亡作用，又分为BH3-only蛋白和多结构蛋白两类，其中Bim、Bad、Bid、Puma和Noxa等属于BH3-only蛋白，而Bax和Bak属于多结构域促凋亡蛋白。Bcl-2家族蛋白通过促凋亡和抗凋亡家族成员的相互作用调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡"主开关"的作用。自1984年科学家们发现Bcl-2蛋白是细胞凋亡与肿瘤之间的重要诱导因子以来，后续的研究发现Bcl-2的过度表达可引起细胞凋亡异常，Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡，增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性，并与肿瘤的发生发展密切相关(W.A.Siddiqui,etal.ArchToxicol(2015)89:289–317)。研究发现，抗凋亡Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)常在血液恶性肿瘤及一系列实体瘤如鼻咽癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌上存在过表达的现象(Callagy,G.M.；etal.ClinCancerRes2006,12,2468-75)。通常癌细胞内Bcl-2和Bcl-xL的过表达预示着对化疗药物耐受性的产生。Kang等人的研究也表明，Bcl-2蛋白家族数目的增多通常与各种癌症的化疗耐药性密切相关；联合使用抗癌化疗药物及Bcl-2蛋白靶向剂，可使疗效增加(Kang,M.H.,etal.ClinCancerRes2009,15,1126-32)。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2可以提高癌细胞凋亡效果，同时可克服化疗药物所带来的肿瘤多药耐药性问题。我们团队早期发现，Nur77孤儿核受体在外界因素的刺激下能够从细胞核转位至线粒体，并与Bcl-2的N端环状结构域相互作用，引起Bcl-2构象转变，暴露出BH3区域，从而使Bcl-2从抑制细胞凋亡的作用转换为促进细胞凋亡的作用；且Nur77的LBD区域的9个氨基酸组成的小肽NuBCP-9是实现此功能的关键区域，能够有效地转换细胞内Bcl-2的抗凋亡作用为促凋亡作用，从而为临床治疗肿瘤特别是Bcl-2高度表达的恶性肿瘤提供了新的解决途径(LinB,etal.Cell2004,116(4):527-540；Kolluri,S.K.,etal.Cancercell2008,14,285-98)。为此，该Bcl-2功能转换肽获得了具有独立自主知识产权的国际专利技术专利(授权号XS0010515)。但由于蛋白多肽类物质在体内不稳定，易被降解清除且本身不能穿透细胞膜，需依赖无选择性的细胞穿膜肽才能进入肿瘤细胞内发挥作用的弊端，使其在临床应用中受到限制。介孔二氧化硅纳米粒子是指直径为纳米级别，并且内部具有的多孔结构的硅纳米材料。该纳米粒子以球形为主，也可以是椭圆形、短棒型或空壳结构。该纳米粒子因结构稳定，生物相容性好，并且内部具有丰富的多孔结构，因而常常被用作药物或者其它生物分子的载体应用于生物医药领域(QianjunHe,etal.Adv.Mater.2014,26,391–411)。传统方法制备的介孔二氧化硅纳米粒子尺寸通常在100nm以上，孔径在1～5nm，能够运载小分子抗肿瘤药物到达肿瘤部位，减少药物对机体的毒副作用，改善疏水药物的水溶性，便于机体对药物的吸收利用等，相关的孔径可调的介孔二氧化硅纳米粒制备方法如专利号CN102583405B。然而，为了提高纳米载体的EPR效应，100nm以下的粒子则更有利于携带药物迅速达到肿瘤组织部位富集并滞留，进而进入肿瘤细胞内发挥作用。另外，孔径的大小决定着介孔二氧化硅所能负载的药物种类及数量，较大的孔径(>5nm)更有利于更多的药物负载量以及可以进行一些大分子药物如siRNA，DNA，多肽，蛋白等的负载。聚酰胺-胺型树状高分子聚合物(PAMAMdendrimers)是一类人工合成的具有树形结构、高度支化、对称、呈辐射状的新型高分子聚合物，其结构由内到外可分为三个部分：初始核、内部重复亚单元和由表面基团构成的外壳。这类大分子具有良好的渗透性、稳定性和生物相容性，同时含有可用于载药的内部空腔结构，分子表面含有大量可修饰基团，是药物载体的理想选择，可作为药物、基因、疫苗的载体，并可用于药物缓释以及靶向释放，其独特的结构性质使其成为许多领域的研究热点(HuYang.Nanomedicine2016,12(2):309–316.MarinaKalomiraki,etal.IntJNanomedicine2016；11:1–12)。基于纳米载体的药物递送系统可提高药物稳定性、控释药物、促进药物体内吸收、改善治疗功效和降低毒副作用等优点，使之成为生物大分子类药物应用的良好传递系统。但多肽、蛋白类药物在储存、合成及载药等方面有较强严苛的条件，易被降解失活，如何设计合适的纳米复合载体系统能把小肽转运到目标位置并能保持其较强的生物活性是现代小肽转运载体研究中所面临的巨大挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对肽类药物在储存、运输、体内循环中的不稳定、失活、难以有效穿透细胞膜的问题，以及化疗药物毒副作用大、难以在耐药性癌细胞内富集的特点，旨在提供双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体及其制备方法与应用，以望实现在癌细胞定点部位释放药物、发挥肽类药物及化疗药物对癌症，尤其是耐药性癌症的协同高效诊治作用；从而有望推动Bcl-2功能转换肽在癌症治疗中的临床应用。所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附等方式制备而成。所述纳米复合载体为球形，粒径在30～100nm。所述纳米复合载体是由介孔二氧化硅和树状高分子聚合物复合而成，其连接方式为静电吸附、共价连接。所述介孔二氧化硅的颗粒尺寸为20～60nm，内部孔径为6～15nm，形貌为球形。所述介孔二氧化硅的表面有可修饰的反应官能团，所述可修饰的反应官能团可为羧基。所述树状高分子聚合物为聚酰胺-胺型树状高分子聚合物或聚赖氨酸型树状高分子聚合物，树状高分子聚合物的端基功能团可为氨基。所述肽类抗癌药物为以Bcl-2为靶点的肽类药物，以Bcl-2为靶点的肽类药物通常为Bcl-2功能转换肽，其氨基酸序列为FSRSLHSLL(NuBCP9)或GDWIDSILAFSRSLHSLLVD(NuBCP20)。所述化疗药物为阿霉素、紫杉醇等常见小分子抗癌药物。所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法包括以下步骤：1)将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺加入反应容器中，用水溶解；在步骤1)中，所述十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺的质量比可为(0.4～10)︰(0.018～1.8)；所述用水溶解可采用60～120ml、80～95℃去离子水溶解并搅拌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附方式制备而成。

【技术特征摘要】
1.双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于由介孔二氧化硅、树状高分子聚合物、肽类抗癌药物、化疗药物通过物理包埋、静电吸附方式制备而成。2.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述纳米复合载体为球形，粒径在30～100nm；所述纳米复合载体由介孔二氧化硅和树状高分子聚合物复合而成，其连接方式为静电吸附、共价连接。3.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述介孔二氧化硅的颗粒尺寸为20～60nm，内部孔径为6～15nm，形貌为球形；所述介孔二氧化硅的表面有可修饰的反应官能团，所述可修饰的反应官能团为羧基。4.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述树状高分子聚合物为聚酰胺-胺型树状高分子聚合物或聚赖氨酸型树状高分子聚合物，树状高分子聚合物的端基功能团为氨基。5.如权利要求1所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体，其特征在于所述肽类抗癌药物为以Bcl-2为靶点的肽类药物，以Bcl-2为靶点的肽类药物通常为Bcl-2功能转换肽，其氨基酸序列为FSRSLHSLL或GDWIDSILAFSRSLHSLLVD；所述化疗药物为阿霉素、紫杉醇小分子抗癌药物。6.如权利要求1～5所述双重负载肽类及化疗药物的纳米复合载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺加入反应容器中，用水溶解；2)向反应体系中加入正硅酸乙酯后离心，洗涤，得含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒；3)在步骤2)所得的含表面活性剂的介孔二氧化硅纳米粒中置于含氯化钠的甲醇溶液中，超声分散后洗涤，真空干燥，得表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒；4)取步骤3)中所得的表面基团为羟基的介孔二氧化硅纳米粒50～100mg超声分散于无水乙醇溶液，再油浴冷凝回流，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷200～800μl，稳定回流过夜，用乙醇洗去未反应物质，得氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；5)取丁二酸酐于反应容器中，加入N，N-二甲基甲酰胺和超纯水混合溶液超声溶解，再加入步骤4)中所得的氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒，然后加入三乙醇胺，搅拌过夜；用去离子水洗去未反应物质，得羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒；6)取步骤5)中所制备得到的羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒与肽类抗癌药物(NuBCP9)混合后搅拌，洗涤得负载肽类...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢静静，许卫霞，张晓坤，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35