一种禽流感合成肽疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于制备禽流感合成肽疫苗的多肽抗原及含有该多肽抗原的疫苗及其制备方法。多肽抗原包括序列1所示的多肽。本发明专利技术提供的禽流感合成肽疫苗具有良好的免疫效力，且疫苗的抗原为化学合成多肽，不含禽流感病毒核酸粒子，安全性高。因此本发明专利技术的疫苗可以有效应对禽流感病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。

A synthetic peptide vaccine for avian influenza and its preparation method

The invention provides a polypeptide antigen for preparing a synthetic avian influenza peptide vaccine and a vaccine containing the polypeptide antigen and a preparation method thereof. Peptide antigens include the polypeptide shown in sequence 1. The avian influenza synthetic peptide vaccine provided by the invention has good immune efficacy, and the antigen of the vaccine is chemically synthesized polypeptide, which does not contain avian influenza virus nucleic acid particles and has high safety. Therefore, the vaccine of the invention can effectively mutate the antigen of avian influenza virus, has no biological safety, is easy to be synthesized on a large scale, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感合成肽疫苗及其制备方法
本专利技术属于医药
，具体而言，本专利技术涉及一种新型禽流感合成肽疫苗，及其制备方法。
技术介绍
禽流感(Avianinfluenza,AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的多种禽类感染的传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病，也被我国列为一类动物疾病。AIV是属于正枯病毒科流感病毒属的A型流感病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8种不同功能的蛋白：多聚酶蛋白PB1、PB2、PA；血凝素蛋白HA；核衣壳蛋白NP；神经氨酸酶蛋白NA；基质蛋白Ml和M2,以及非结构蛋白NS1和NS2,其中，血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2蛋白为禽流感病毒的三种表面抗原分子，针对这三种抗原的抗体都有抑制流感病毒感染的作用。禽流感灭活疫苗的保护效力具有亚型特异性，而禽对已知的15种HA亚型都易感，且无法预测什么时候家禽会感染哪种亚型，一次使用预防性疫苗来阻止所有可能的亚型禽流感的发生是不现实的。此外，HA和NA抗原性变异频率很高，不同变异株不产生交叉保护，研制此类抗原疫苗的速度往往跟不上病毒变异，这就是目前我国虽不断使用疫苗，但禽流感却不断爆发的原因所在。为此，禽病科学家一直致力于研究其他类型的疫苗，如DNA疫苗，现已诞生了由杆状病毒表达的禽流感病毒H5N1的HA基因制成的亚单位疫苗；表达HA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗。这些疫苗的一个突出优点就是只使用了禽流感病毒的某一种或某二种抗原成分，这样有利于开发针对性地检测方法对疫情进行监测。但是，这些疫苗同样无法提供抵抗各种亚型的禽流感的交叉保护作用。因此，开发新型的广泛性防治禽流感病毒感染的技术成为科学工作者的研究热点。跨膜蛋白M2是除HA、NA外的第3种跨膜蛋白，含有97个氨基酸，分子质量约为15ku。它的编码基因位于AIV基因组的第7个节段上，并由它的第2个小mRNA翻译。M2蛋白不含糖基，具有高度保守性。感染细胞的细胞膜上的A型禽流感病毒的M2蛋白与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端在细胞内。细胞外部分有24个氨基酸(M2e)，跨膜区是由19个氨基酸组成的疏水区，羧基端的54个氨基酸位于细胞膜内。M2蛋白是A型禽流感病毒的一个高度保守性的跨膜蛋白(同源性达90％),特别是氨基端的10个氨基酸是非常保守的，在所测得的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。传统疫苗是将病原体灭活或减毒制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病疫苗的方向。相对于传统的弱毒苗和灭活苗以及其他几种新型的疫苗，合成肽类疫苗安全、无毒、稳定，由于其分子结构小而简单，很少会出现严重的并发症及医源性感染问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于制备禽流感合成肽疫苗的多肽抗原及含有该多肽抗原的新型合成肽疫苗的制备方法。为实现上述目的，本专利技术通过对禽流感毒株的序列测定，研究禽流感主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行禽流感抗原位点的分析预测，研制出一种效力好、安全性高、生产工艺稳定且成本低的合成肽疫苗。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一、禽流感多肽抗原的设计本专利技术提供一种用于禽流感合成肽疫苗的多肽抗原，其中所述多肽的氨基酸序列1所示。本专利技术通过对禽流感流行毒株的序列测定，研究禽流感主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行禽流感抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受禽流感流行毒株攻击的多肽抗原。二、禽流感多肽抗原的制备本专利技术还提供了氨基酸序列如序列1所示的多肽的制备方法，是利用Merrifield固相合成法制备序列表中序列1所示的多肽，其中，采用了9-芴甲氧羰基修饰的氨基酸，固相载体为RinkAmideMBHA树脂，该制备方法如下：(1)去保护反应：在体积百分比为20％-40％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-25℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯丙三氮唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三唑酯；(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-25℃条件下反应1-4小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮清洗树脂；(4)乙酰化反应：使用重量体积百分比1.5％-4％(g/ml)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-25℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)-(4)，反应完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；(6)多肽与树脂的分离：向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0℃下反应10分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基甲醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽抗原；(7)超滤纯化多肽及无菌处理：使用膜包在20-25℃条件下超滤多肽溶液，使用0.22μm滤器除菌保存。三、禽流感合成肽疫苗的配制本专利技术还提供了一种禽流感合成肽疫苗，其中包括氨基酸序列如序列1所示的多肽抗原。该疫苗具体的制备方法如下：(1)用注射用水将上述多肽稀释至50pg/ml制成多肽溶液；(2)在20-25℃条件下，按照多肽溶液：佐剂＝1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，80-100转/分钟慢速搅拌2-5分钟；(3)缓慢加入多肽，搅拌20-30分钟；(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。在上述制备方法中，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。所述佐剂选自SEPPIC50V、SEPPICMONTANIDEISA61油佐剂等。此外，本专利技术还提供了上述的多肽抗原，包含上述多肽抗原的疫苗在制备治疗和/或预防禽流感的药物中的用途。特别地，本专利技术还提供了上述多肽抗原以及疫苗在制备预防和/或治疗禽流感，例如高致病性禽流感的药物中的用途。综上所述，本专利技术人在研究禽流感病毒序列变异规律的基础上，通过计算机分析设计，以及大量的筛选和测试工作，最终获得本专利技术多肽抗原序列，并合成了本专利技术的多肽，将其用于疫苗的制备，并对这些多肽进行了疫苗安全性和效力试验。结果表明，该疫苗可以有效应对禽流感病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。下述实施方式中，所用的材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。实施例1:合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本实施例为本专利技术所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本专利技术的多肽抗原可以通过全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的氨基酸，固相载体为RinkAmideMBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。1、合成原料的准备合成肽疫苗多肽抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备禽流感合成肽疫苗的多肽抗原，其中所述多肽抗原的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于制备禽流感合成肽疫苗的多肽抗原，其中所述多肽抗原的氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.一种禽流感合成肽疫苗，包含权利要求1所述的多肽抗原。3.根据权利要求2所述的禽流感合成肽疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。4.一种权利要求1中所述的多肽抗原的制备方法，是利用Merrifield固相合成法制备序列表中序列1所示的多肽，其中，采用了9-芴甲氧羰基修饰的氨基酸，固相载体为RinkAmideMBHA树脂，包括以下步骤：(1)去保护反应：在体积百分比为20％-40％的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-25℃条件下反应25-40分钟，脱除树脂氨基上的9-芴甲氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；(2)氨基酸的活化：将合成用的带有9-芴甲氧羰基保护基团的各个氨基酸与1-羟基苯并三氮唑反应合成氨基酸-1-羟基苯丙三氮唑酯；(3)缩合反应：使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-25℃条件下反应1-4小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮清洗树脂；(4)乙酰化反应：使用重量体积百分比为1.5％-4％(g/ml)的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-25℃条件下反应20-40分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；(5)合...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖进，宋芳，闫福栋，胡艳欣，巴利民，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11