The present disclosure relates to methods for amplifying Sertoli cells (e.g., Lgr5 + Sertoli cells) and differentiating Sertoli cells (e.g., Lgr5 + Sertoli cells) into inner ear hair cells (e.g., atonic homologue 1 (Atoh1) + inner ear hair cells), as well as to inner ear hearing support cells and hair cells, for example, for identifying candidate therapeutic compounds for treating hearing loss and balance loss. Purpose. In addition, this method can be used to treat subjects with hearing loss and balance loss who will benefit from increased proliferation and differentiation of Sertoli cells (e.g. Lgr5 + Sertoli cells) in the inner ear.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】内耳支持细胞的扩增和分化及其使用方法优先权要求本申请要求2016年1月29日提交的美国临时申请序列号62/288,958的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。专利
本文中描述了用于扩增和分化来自哺乳动物内耳的感觉上皮的内耳支持细胞(例如，Lgr5+内耳支持细胞)的方法，以及扩增的细胞例如用于鉴定用于治疗听力损失或平衡损失的候选治疗化合物的方法的用途。另外，本文中描述的方法可以用于治疗听力损失或平衡损失，其将受益于内耳支持细胞(例如，Lgr5+内耳支持细胞)的增殖，以及其分化成内耳毛细胞(例如，无调性同源物1(atonalhomolog1，Atoh1)+内耳毛细胞)的增加。专利技术背景WHO估计听力损伤是影响全球5％以上人口(3.6亿人，包括3200万儿童)的主要健康挑战。检测声音并通过听觉神经将其信号传递到脑的感觉毛细胞易受损伤。在损失之后，毛细胞不被替换1,2，因此在出生后开始时低(每耳15,000)的细胞数随着年龄的增长而减少，并且细胞替换的缺乏导致获得性聋形式的高患病率。实际上，通常由噪音暴露、耳毒性药物、病毒/细菌感染和衰老引起的毛细胞和听神经损...
【技术保护点】
1.产生扩增的内耳支持细胞群体的方法，该方法包括使内耳支持细胞群体与一种或多种选自下组的试剂接触：(a)类视黄醇受体信号传导激活剂；(b)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(c)表B中列出的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂；(d)表C中列出的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)激活剂；(e)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂；(f)表E中列出的Notch信号传导激活剂；(g)表F中列出的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；(h)表G中列出的蛋白质降解抑制剂；(i)表H中列出的PI3K‑Akt信号传导抑制剂；和(j)表I中列出的cAMP响应元件结合蛋白(CREB)激活剂，其中所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.29 US 62/288,9581.产生扩增的内耳支持细胞群体的方法，该方法包括使内耳支持细胞群体与一种或多种选自下组的试剂接触：(a)类视黄醇受体信号传导激活剂；(b)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(c)表B中列出的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂；(d)表C中列出的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)激活剂；(e)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂；(f)表E中列出的Notch信号传导激活剂；(g)表F中列出的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；(h)表G中列出的蛋白质降解抑制剂；(i)表H中列出的PI3K-Akt信号传导抑制剂；和(j)表I中列出的cAMP响应元件结合蛋白(CREB)激活剂，其中所述一种或多种试剂以足以产生扩增的内耳支持细胞群体的量存在。2.权利要求1的方法，其中所述Notch信号传导激活剂是Delta样蛋白激活剂、Jagged蛋白激活剂、Notch激活剂和/或γ-分泌酶激活剂。3.权利要求1的方法，其中所述一种或多种试剂选自下组：(a)类视黄醇受体信号传导激活剂；(b)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(c)表B中列出的BMP信号传导抑制剂；(d)表C中列出的CDK激活剂；和(e)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述扩增的内耳支持细胞群体是扩增的Lgr5+内耳支持细胞群体。5.权利要求4的方法，其中所述扩增的Lgr5+内耳支持细胞群体是扩增的Lgr5+耳蜗支持细胞群体。6.权利要求4的方法，其中所述扩增的Lgr5+内耳支持细胞群体是扩增的Lgr5+前庭支持细胞群体。7.促进内耳支持细胞群体分化成内耳毛细胞群体的方法，该方法包括使内耳支持细胞群体与一种或多种选自下组的试剂接触：(a)类视黄醇受体信号传导激活剂；(b)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(c)表B中列出的BMP信号传导抑制剂；(d)表C中列出的CDK激活剂；(e)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂；(f)表F中列出的HDAC抑制剂；(g)表G中列出的蛋白质降解抑制剂；(h)表H中列出的PI3K-Akt信号传导抑制剂；(i)表I中列出的CREB激活剂；和(j)表J中列出的Notch信号传导抑制剂，其中所述一种或多种试剂以足以促进分化成内耳毛细胞群体的量存在。8.权利要求7的方法，其中所述一种或多种试剂选自下组：(a)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(b)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂；(c)表F中列出的HDAC抑制剂；(d)表G中列出的蛋白质降解抑制剂；和(e)表J中列出的Notch信号传导抑制剂。9.权利要求7或8的方法，其中所述Notch信号传导抑制剂是Delta样蛋白抑制剂、Jagged蛋白抑制剂、Notch抑制剂和/或γ-分泌酶抑制剂。10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述内耳毛细胞群体是无调性同源物1(Atoh1)+内耳毛细胞群体。11.权利要求10的方法，其中所述Atoh1+内耳毛细胞群体是Atoh1+耳蜗毛细胞群体。12.权利要求10的方法，其中所述Atoh1+内耳毛细胞群体是Atoh1+前庭毛细胞群体。13.权利要求1-7和9-12中任一项的方法，其中所述类视黄醇受体信号传导激活剂是表K中列出的视黄酸受体(RAR)激动剂或表K中列出的视黄酸X受体(RXR)激动剂。14.权利要求13的方法，其中所述RAR激动剂是RARα激动剂、RARβ激动剂和/或RARγ激动剂。15.权利要求13的方法，其中所述RXR激动剂是RXRα激动剂、RXRβ激动剂和/或RXRγ激动剂。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述Wnt信号传导激活剂是糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂、Wnt激活剂、Frizzled受体激活剂、脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)激活剂、Disheveled(Dvl)激活剂、Axin抑制剂、Dickkopf(Dkk)抑制剂、分泌性Frizzled相关蛋白(sFRP)抑制剂、Groucho抑制剂和/或Wnt抑制蛋白(WIF)抑制剂。17.权利要求1-7和9-16中任一项的方法，其中所述BMP信号传导抑制剂是Noggin激活剂、Chordin激活剂、BMP受体抑制剂、SMAD1/5/8抑制剂、SMAD2/3抑制剂和/或SMAD4抑制剂。18.权利要求1-7和9-17中任一项的方法，其中所述CDK激活剂是p27Kip1抑制剂和/或视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)抑制剂。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述E盒依赖性转录激活剂是Atoh1激活剂。20.权利要求1、2和4-19中任一项的方法，其中所述HDAC抑制剂是HDACI类抑制剂、HDACII类抑制剂、HDACIII类抑制剂和/或泛-HDAC抑制剂。21.权利要求20的方法，其中所述HDACIII类抑制剂是SIRT1抑制剂和/或SIRT2抑制剂。22.权利要求1、2和4-21中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂是蛋白酶体抑制剂或泛素连接酶抑制剂。23.权利要求1、2、4-7和9-22中任一项的方法，其中所述PI3K-Akt信号传导抑制剂是Akt抑制剂、PI3K抑制剂、PKC抑制剂和/或PDK1抑制剂。24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述内耳支持细胞群体是Lgr5+内耳支持细胞群体。25.权利要求24的方法，其中所述Lgr5+内耳支持细胞群体是Lgr5+耳蜗支持细胞群体。26.权利要求24的方法，其中所述Lgr5+内耳支持细胞群体是Lgr5+前庭支持细胞群体。27.人细胞，其包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含在选自下组的内耳支持细胞标志物的调节元件控制下的第一报告基因：Lgr5、Sox2、p27、Prox1、FGFR3、Glast和Lfng，所述第二重组核酸分子包含在选自下组的内耳毛细胞标志物的调节元件控制下的第二报告基因：Atoh1、Myo7a、Cdh23、Pcdh15、Myo6、Myo1c、Tmc1和Cav1.3，其中所述第一报告基因不同于所述第二报告基因。28.权利要求27的细胞，其中所述内耳支持细胞标志物是Lgr5。29.权利要求27的细胞，其中所述内耳毛细胞标志物是Atoh1。30.权利要求28或29的细胞，其中所述内耳支持细胞标志物是Lgr5，并且所述内耳毛细胞标志物是Atoh1。31.权利要求28-30中任一项的细胞，其中内耳支持细胞标志物的调节元件是Lgr5启动子。32.权利要求28-30中任一项的细胞，其中内耳毛细胞标志物的调节元件是Atoh1增强子。33.权利要求32的细胞，其中所述Atoh1增强子与SV40启动子或珠蛋白启动子可操作连接。34.权利要求27-33中任一项的细胞，其中所述第一报告基因编码第一荧光蛋白，并且所述第二报告基因编码第二荧光蛋白，其中所述第一荧光蛋白不同于所述第二荧光蛋白。35.转基因小鼠，其具有稳定整合到所述小鼠的基因组中的两种或更多种重组核酸分子，其包含至少第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含在选自下组的内耳支持细胞标志物的调节元件控制下的第一报告基因：Lgr5、Sox2、p27、Prox1、FGFR3、Glast和Lfng，所述第二重组核酸分子包含在选自下组的内耳毛细胞标志物的调节元件控制下的第二报告基因：Atoh1、Myo7a、Cdh23、Pcdh15、Myo6、Myo1c、Tmc1和Cav1.3，其中所述第一报告基因不同于所述第二报告基因。36.权利要求35的转基因小鼠，其中所述内耳支持细胞标志物是Lgr5。37.权利要求35的转基因小鼠，其中所述内耳毛细胞标志物是Atoh1。38.权利要求36或37的转基因小鼠，其中所述内耳支持细胞标志物是Lgr5，并且所述内耳毛细胞标志物是Atoh1。39.权利要求36-38中任一项的转基因小鼠，其中内耳支持细胞标志物的调节元件是Lgr5启动子。40.权利要求36-38中任一项的转基因小鼠，其中内耳毛细胞标志物的调节元件是Atoh1增强子。41.权利要求40的转基因小鼠，其中所述Atoh1增强子与SV40启动子或珠蛋白启动子可操作连接。42.权利要求35-41中任一项的转基因小鼠，其中所述第一报告基因编码第一荧光蛋白，并且所述第二报告基因编码第二荧光蛋白，其中所述第一荧光蛋白不同于所述第二荧光蛋白。43.从权利要求35-42中任一项的转基因小鼠分离的细胞，其包含所述第一重组核酸分子和所述第二重组核酸分子。44.权利要求43的细胞，其中所述细胞从所述转基因小鼠的内耳分离。45.鉴定用于治疗与耳蜗或前庭毛细胞损失相关的听力损失或平衡损失的候选试剂的方法，该方法包括：(a)从权利要求35-42中任一项的小鼠中分离内耳支持细胞群体；(b)在足以产生扩增的内耳支持细胞群体的条件下维持所述内耳支持细胞群体；(c)将测试化合物施用于所述扩增的内耳支持细胞群体；(d)检测在存在所述测试化合物的情况下所述扩增的内耳支持细胞群体中所述第一报告基因和所述第二报告基因的表达水平；并且(e)选择测试化合物作为用于治疗听力损失或平衡损失的候选试剂，所述测试化合物与缺乏所述测试化合物的情况下所述第一报告基因的表达水平相比增加所述第一报告基因的表达水平，和/或与缺乏所述测试化合物的情况下所述第二报告基因的表达水平相比增加所述第二报告基因的表达水平。46.权利要求45的方法，其中所述足以产生扩增的内耳支持细胞群体的条件包括在存在一种或多种生长因子的情况下的培养基，优选DMEM和F12培养基的混合物，优选1:1混合物，所述生长因子优选是表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或胰岛素样生长因子(IGF1)。47.权利要求45或46的方法，其中所述足以产生扩增的内耳支持细胞群体的条件还包含一种或多种选自下组的试剂：(a)类视黄醇受体信号传导激活剂；(b)表A中列出的Wnt信号传导激活剂；(c)表B中列出的BMP信号传导抑制剂；(d)表C中列出的CDK激活剂；(e)表D中列出的E盒依赖性转录激活剂；(f)表E中列出的Notch信号传导激活剂或表J中列出的Notch信号传导抑制剂；(g)表F中列出的HDAC抑制剂；(h)表G中列出的蛋白质降解抑制剂；(i)表H中列出的PI3K-Akt信号传导抑制剂；和(j)表I中列出的CREB激活剂。48.权利要求47的方法，其中所述类视黄醇受体信号传导激活剂是表K中列出的RAR激动剂或表K中列出的RXR激动剂。49.权利要求47或48的方法，其中所述足以产生扩增的内耳支持细胞群体的条件包括表1中列出的一种或多种试剂。50.权利要求45-49中任一项的方法，其中所述足以产生扩增的内耳支持细胞群体的条件包括补充有N2、B27、EGF、bFGF、IGF1、CHIR99021和VPA的培养基，优选DMEM和F12的1:1混合物。51.权利要求45-50中任一项的方法，其中所述候选试剂选自下组：小分子、化合物、核酸、肽、多肽、生长因子和表观遗传修饰剂。52.权利要求45-51中任一项的方法，其中通过包...
【专利技术属性】
技术研发人员：A艾吉，M韦努蒂，A切克奥维茨，
申请(专利权)人：马萨诸塞眼科耳科诊所，分贝疗法股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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