一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法技术

本发明专利技术属于多糖类物质分子量检测技术领域，具体涉及的是一种左聚糖(Levan)分子量测定及分离制备的方法。一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法，包括以下步骤：自装GPC渗透凝胶色谱柱分子量检测参数优化选择、分离纯化参数优化选择、酶标法高通量检测糖含量，糖类物质分子量的测定及分离制备过程。本方法能够快速方便地分离纯化不同分子量的左聚糖，尤其适合左聚糖分子量的快速分析测定以及根据不同分子量进行左聚糖的分离制备。本发明专利技术具有成本低、操作方便、准确性高的优点，具有很好的生产应用和研究价值。

A Method for Determining the Molecular Weight of Left Polysaccharide and Separating and Preparing Left Polysaccharide

The invention belongs to the technical field of molecular weight detection of polysaccharides, in particular to a method for molecular weight determination and separation and preparation of levopolysaccharides. A method for the determination and separation of the molecular weight of the left glycan includes the following steps: optimization of molecular weight detection parameters, optimization of separation and purification parameters, high throughput detection of sugar content, determination of carbohydrate molecular weight and separation and preparation process of self-assembled GPC permeation gel column. This method can be used to separate and purify levopolysaccharides with different molecular weights quickly and conveniently, especially for the rapid analysis and determination of the molecular weights of levopolysaccharides and the separation and preparation of levopolysaccharides according to different molecular weights. The invention has the advantages of low cost, convenient operation and high accuracy, and has good production application and research value.

【技术实现步骤摘要】
一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法
本专利技术属于多糖类物质分子量检测
，具体涉及的是一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法。
技术介绍
多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作，不论在多糖性质的研究，或是在它的用途等方面，都涉及到分子量方面的问题，往往需要测定它的分子量，因而测定分子量成为研究和制备多糖一项经常性的工作。常见用于多糖物质分子量的测定方法有：渗透压法、蒸汽渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法和超过率法等。其中(GPC)凝胶色谱法又称为尺寸排阻色谱法，其测定原理是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，用来分离不同分子量的物质，并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。此方法中样品分子与固定相凝胶之间无相互固定作用，完全按照分子筛原理分离。现在实验室用的(HPGPC)高效凝胶渗透色谱法，该实验所用的色谱柱不能自己装填，均为商品柱。常用的商品柱有μ-Bondagel柱系和TSK柱系。为增加分辨率往往需要将两个不同分离范围的色谱柱联用，这就更加使实验室所用仪器费用增加。再加之需要高效液相色谱仪和示差检测器等仪器，整套仪器下来费用较高。另外一种可以自己装填柱子的方法，相对(HPGPC)高效凝胶渗透色谱法而言实验仪器费用有所减少，但所用填料多为进口，例如：Sephacyl、Sephadex等系列填料，但价格均很昂贵。此外，在自装柱方法的多糖含量检测中，苯酚硫酸法较为常用。苯酚硫酸比色法测定多糖的原理是先将多糖在浓硫酸作用下水解成单糖再迅速生成糖醛衍生物进而与苯酚发生显色反应。多数反应体系为1ml苯酚溶液和5ml苯酚溶液在试管中进行反应，然后用取适量于比色皿中用分光光度计检测。此方法反应所用试剂有一定的毒性和危险性，在加反应试剂、反应过程中、用完试管后的清洗中试剂对人的毒害作用相对较大。且为达到好的分离效果经常会收集很多管收集，用分光光度计逐一检测实验进程较慢，误差较大。而对于大多数工厂和小型实验室而言，并没有足够的硬件条件来达到以上两种检测方法的要求。因此，寻找一种经济高效的凝胶柱填料和开发一种安全准确的高通量检测系统具有很重要的意义。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供了一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法。本专利技术提供的技术方案如下：一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法，包括如下步骤：(1)工作参数及实验操作：1)色谱柱：采用自装渗透凝胶柱；2)柱温：4-25℃；3)流动相；4)流速；5)进样体积；6)收集范围：使用自动收集器以1-2min/管进行收集；(2)检测：以苯酚-硫酸法为基础手动加样，酶标仪OD490nm进行读数的高通量检测糖含量方法，步骤如下：取200μl样品待测液于EP管中→加入100μL6％苯酚溶液后迅速加入500μL浓硫酸溶液→盖上EP管盖子，轻轻震荡摇匀后沸水浴6min→置于冰水浴中变凉，取200μl反应后的溶液于酶标板用酶标仪OD490nm进行测定；(3)葡萄糖标准曲线的制定：葡萄糖标准曲线的制定采用步骤(2)中所述方法；(4)分子量测定操作：以上述步骤(1)中的特征参数为指导进行分子量检测及分离制备：装柱→处理样品→上样→洗脱→收集→加试剂检测→处理数据并分析；(5)分离纯化流程：装柱→处理样品→上样→洗脱→收集→冷冻干燥→称重计算回收率→分子量检测验证，若不是单一对称的峰，则需重复上样分离。作为优选，步骤(1)中的自装渗透凝胶柱的填料为高流速6FF琼脂糖微球，所述自装渗透凝胶柱其排阻极限范围为10-400kDa，所述自装渗透凝胶柱的柱径比范围为1:15-1:20。作为优选，步骤(1)中的流动相为蒸馏水、去离子水、0.1％-2％的Na2SO4缓冲液或0.1M的BP缓冲液。作为优选，步骤(1)中的进样体积为柱体积的1-2％；洗脱流速为0.2-1mL/min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本方法能够快速方便地分离纯化不同分子量的左聚糖，尤其适合左聚糖分子量的快速分析测定以及根据不同分子量进行左聚糖的分离制备。(2)本专利技术方法不需要昂贵的液相色谱仪，采用性价比高并且可回收多次重复利用的特殊填料制备分离柱，过程简便，成本相对较低，分离效果好，填料使用寿命长，既可以定性定量分析微量样品，也可以通过放大体系用于分离制备，本专利技术具有成本低、操作方便、准确性高的优点，具有很好的生产应用和研究价值。附图说明图1为葡萄糖标准曲线；图2为定量标准曲线；图3为左聚糖(levan)分子量测定结果；图4为第22min分子量检测；图5为第46min分子量检测。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。实施例1：一种苯酚-硫酸显色酶标法高通量检测糖含量的方法，包括标准曲线的制定，步骤如下：(1)试剂：6％苯酚溶液(称取苯酚，加入去离子水搅拌，待充分溶解后用容量瓶定容，配制成6％苯酚溶液)、浓硫酸(试剂不可长期放置)(2)操作步骤：取200μl样品待测液于EP管中→加入100μL6％苯酚溶液后迅速加入500μL浓硫酸溶液→盖上EP管盖子，轻轻震荡摇匀后沸水浴6min→置于冰水浴中变凉，取200μl反应后的溶液于酶标板用酶标仪OD490nm进行测定。(3)葡萄糖标准曲线的制作①葡萄糖标准溶液的制备：准确称取0.1g烘干至恒重的葡萄糖标品于烧杯中，加入缓冲液搅拌至多糖完全溶解，定容至1000mL，得到葡萄糖标准溶液。②分别取一系列不同体积的葡萄糖标准溶液(见表1)，加入去离子水缓冲液补足到200μL，得到一系列不同葡萄糖终浓度的待测液。采用苯酚-硫酸显色酶标法高通量检测糖含量中的操作步骤进行进行实验操作，得到OD490nm度数，然后以吸光度为纵坐标，以葡萄糖标品浓度为横坐标，绘制标准曲线。表1葡萄糖标准溶液如图1所示，得到标准曲线方程为y＝0.0498x-0.005，其R2＝0.9993，线性良好，说明本专利技术方法可以进行定量分析。实施例2：多糖分子量标曲的制定1、装柱(1)让所有的材料和试剂达到室温。配制缓冲液。凝胶层析上样、平衡和洗脱只用一种低盐浓度的缓冲液。(2)选择一根长内径1cm长40cm的柱子，根据柱子大小取所需量的凝胶(约为柱床体积的1.15倍)，清洗掉20％乙醇，抽干，用缓冲液(按凝胶:缓冲液＝3：1的比例)配成匀浆。匀浆用超声波清洗机作20min脱气处理。(3)固定柱子，与地面垂直。(4)打开柱子上端，关闭柱子下端将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位(液面略高于滤膜)，务必使底端无气泡。(5)用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开出口端夹子，流出液收到废液缸。(6)随着液体的流出不断地补充胶液到柱子中，直至胶床沉积到理想的高度，并形成水平的胶平面。试验中经过沉降形成胶床20cm。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)工作参数及实验操作：1)色谱柱：采用自装渗透凝胶柱；2)柱温：4‑25℃；3)流动相；4)流速；5)进样体积；6)收集范围：使用自动收集器以1‑2min/管进行收集；(2)检测：以苯酚‑硫酸法为基础手动加样，酶标仪OD490nm进行读数的高通量检测糖含量方法，步骤如下：取200μl样品待测液于EP管中→加入100μL6％苯酚溶液后迅速加入500μL浓硫酸溶液→盖上EP管盖子，轻轻震荡摇匀后沸水浴6min→置于冰水浴中变凉，取200μl反应后的溶液于酶标板用酶标仪OD490nm进行测定；(3)葡萄糖标准曲线的制定：葡萄糖标准曲线的制定采用步骤(2)中所述方法；(4)分子量测定操作：以上述步骤(1)中的特征参数为指导进行分子量检测及分离制备：装柱→处理样品→上样→洗脱→收集→加试剂检测→处理数据并分析；(5)分离纯化流程：装柱→处理样品→上样→洗脱→收集→冷冻干燥→称重计算回收率→分子量检测验证，若不是单一对称的峰，则需重复上样分离。

【技术特征摘要】
1.一种左聚糖分子量测定及分离制备的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)工作参数及实验操作：1)色谱柱：采用自装渗透凝胶柱；2)柱温：4-25℃；3)流动相；4)流速；5)进样体积；6)收集范围：使用自动收集器以1-2min/管进行收集；(2)检测：以苯酚-硫酸法为基础手动加样，酶标仪OD490nm进行读数的高通量检测糖含量方法，步骤如下：取200μl样品待测液于EP管中→加入100μL6％苯酚溶液后迅速加入500μL浓硫酸溶液→盖上EP管盖子，轻轻震荡摇匀后沸水浴6min→置于冰水浴中变凉，取200μl反应后的溶液于酶标板用酶标仪OD490nm进行测定；(3)葡萄糖标准曲线的制定：葡萄糖标准曲线的制定采用步骤(2)中所述方法；(4)分子量测定操作：以上述步骤(1)中的特征参数为指导进行分子量检测及分离制备：装柱→处理样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨辉，侯媛媛，仝秋平，张茜，罗宁，朱萍，梁海秋，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45