本发明专利技术涉及一种基于睡眠剥夺的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型构建方法，包括以下步骤：采用苯酚在大鼠侧颊粘膜处灼烧，造成白色损伤，24‑48小时后得到口腔溃疡动物模型；将该动物模型置于多平台水环境装置内2‑7天；所述的多平台水环境装置是由一个鼠箱，内置若干个直径为4‑8cm，彼此间距为10‑20cm的平台组成；平台之间用水填充，平台高出水面约0.1‑2cm。本发明专利技术克服了现有技术中评价指标单一，模型持续时间短，病因与临床不符等缺陷。
Establishment of an animal model of oral ulcer with Yin deficiency and Fire exuberance based on sleep deprivation
The present invention relates to a method for constructing an animal model of oral ulcer of Yin deficiency and Fire exuberance type based on sleep deprivation, which includes the following steps: burning phenol at the buccal mucosa of rats, causing white damage, obtaining an animal model of oral ulcer after 24 to 48 hours; placing the animal model in a multi-platform water environment device for 2 to 7 days; and the multi-platform water environment device is composed of a rat box; Built-in platforms with diameter of 4 8 cm and spacing of 10 20 cm are composed of platforms, which are filled with water and are about 0.1 2 cm above the water surface. The invention overcomes the defects of single evaluation index, short duration of model and inconsistent etiology with clinical practice in the prior art.
【技术实现步骤摘要】
一种基于睡眠剥夺的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型的构建方法
本专利技术涉及医药研究领域的动物模型构建方法。
技术介绍
中医认为，对于人体具有滋润、凝聚、抑制阳热等作用的物质和功能统属于阴。阴虚证是指机体阴液亏耗，阴不制阳，导致阳相对亢盛，出现燥、热、升、动，机能虚性亢奋的病理状态。《本草经解》曰“七伤者，食伤、忧伤、饮伤、房室伤、饥伤、劳伤、经络营卫气伤之七伤也，七伤皆伤真阴”。当前，人类由于熬夜引起的虚火上升普遍存在。现代医学对阴虚火旺病理生理学研究主要围绕在内分泌系统、免疫、能量代谢、代谢调控等方面，对阴虚火旺证候的本质有了初步的解释。2002年版《中药新药临床研究指导原则》将复发性口疮分为胃火上炎、心脾积热、脾虚湿困、阴虚火旺、脾肾阳虚5个证候，阴虚火旺为复发性口腔溃疡常见证候之一。阴虚火旺型口腔溃疡经久不愈，反复发作，伴有腰膝，遗精盗汗，骨蒸潮热，舌红少苔，此型多与免疫系统疾病有关。口腔溃疡病因复杂，发病机制尚未明确，可能与遗传、免疫、微生物、系统疾病、激素、维生素及微量元素的缺乏、心理因素等因素有关。专利申请201710902646.2公开了一种阴虚火旺型口腔溃疡动物模型制作方法，该方法通过皮下注射三碘甲状腺原氨酸溶联合苯酚灼伤的方式，首次专利技术了一种阴虚火旺型口腔溃疡动物模型制作方法。但该方法仍存在以下不足，其证候造模思路是模拟阴虚的临床症状，在病因上与临床有较大出入；所检测的生化指标少且与阴虚火旺的现代研究及口腔溃疡的复杂病因关联不足；同时，模型持续时间不够长。因此有必要建立一种与阴虚火旺型口腔溃疡复杂病因高度相关的病证结合模型，应用该模型具有更全面的生化指标检测，对治疗阴虚火旺口腔炎症药物进行更深入的药效研究。
技术实现思路
为克服以上技术缺陷，本专利技术提供了一种因睡眠不足而致的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型的制作方法，该方法克服了现有技术存在评价指标单一，模型持续时间短，病因与临床不符的缺陷。本专利技术采用的技术方案如下：选取SD大鼠，暴露左右两侧颊黏膜，将苯酚浸透的棉球放在大鼠两侧颊黏膜上灼烧，造成白色损伤。48小时后，对大鼠进行睡眠剥夺后可得目标动物模型。具体包括以下步骤：一、制备口腔溃疡的动物模型：采用苯酚在大鼠侧颊粘膜处灼烧，造成白色损伤，24-48小时后得到口腔溃疡动物模型；二、建立睡眠剥夺型阴虚火旺证模型：将步骤1的动物模型置于睡眠剥夺装置内2-7天；所述装置是由一个鼠箱，内置若干个直径为4-8cm，彼此间距为10-20cm的平台组成；平台之间用水填充，平台高出水面约0.1-2cm。该装置的作用是：可让大鼠自行在不同平台上活动，当大鼠进入睡眠时，由于全身肌肉张力降低，节律性地垂头触水而醒来，从而达到睡眠剥夺的目的。所述平台高度为5-10cm，水的温度为20-25℃；所述大鼠为SD大鼠，体重在150-350g。所述平台直径优选6.3cm，平台之间间隔优选15cm，平台高出水面距离优选1cm。所述口腔溃疡动物模型置于睡眠剥夺装置内的天数优选3天。本专利技术建立的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型在研究清热降火，治疗各种口腔炎症疾病药物中应用。本专利技术提供的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型的制作方法和现有的方法相比具有以下优点：本专利技术提供了一种接近临床病证特征，持续时间更长，生化指标检测与阴虚火旺证现代研究和口腔溃疡复杂病因密切相关动物模型。睡眠剥夺贴近人类由于熬夜引起的虚火上升。该模型同时能考察阴虚证的病因对疾病的影响，更全面深入研究清热降火方治疗口腔疾病药物的药效，具有重要的应用价值。附图说明图1为睡眠剥夺装置；图2为HE染色下大鼠口腔黏膜组织病理观察结果图示；图3为大鼠口腔溃疡面积变化情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不局限于此。1.实验材料(1)实验动物：选用50只SPF级成年雄性SD大鼠，体重200-260g,由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。(2)实验试剂：异氟烷、苯酚、甲酸、水合氯醛、生理盐水、5-羟色胺(5-HT))、γ-氨基丁酸GABA)、皮质酮(CORT)；促肾上腺皮质激素(ACTH)、免疫球蛋白M(IgM)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)检测试剂盒。(3)实验仪器：自制睡眠剥夺装置，麻醉机(MATRX)，电子分析天平(Sartorius)，红外电子体温计(可孚)，冰箱(Hair)，塑料细管(长6cm、内径约4mm)。睡眠剥夺装置的结构说明：睡眠剥夺装置是一多平台水环境装置，该装置是由一个鼠箱(1)，内置若干个直径为4-8cm，彼此间距为10-20cm的平台(2)组成；平台之间(3)用水填充，平台(2)高出水面约0.1-2cm。2实验方法(1)实验分组：SD大鼠随机分成3组，分别为正常组20只，口腔溃疡组(OU组)20只，阴虚火旺型口腔溃疡组(YU组)10只。动物在环环境中适应一周后开始实验。(2)试剂配制：苯酚先微热融化，再用蒸馏水稀释至95％。(3)造模方法：实验开始第1天，OU组和YU组经异氟烷麻醉，暴露左右两侧颊黏膜，接着将一小棉球置于圆管(长6cm、内径约4mm)一端并与管口齐平，滴加95％苯酚至刚好浸透棉球，最后将塑料管的棉球端平放在大鼠两侧颊黏膜上灼烧40s，，可见直径约为4mm的圆形白色损伤，经过48h，用异氟烷麻醉后观察，并用数码相机拍照，随机从正常组和OU组中选取10只大鼠，经腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉，腹主动脉取血，取口腔黏膜组织和脑组织，测定相关指标。从第3天开始，YU组睡眠剥夺3天，在第6天，观察拍照，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，取口腔黏膜组织和脑组织，测定相关指标。3模型评价3.1阴虚火旺证评价3.1.1一般状态：观察记录毛色变化、大小便及情绪激惹情况等。体重：每天上午用电子天平对大鼠称重。体温：每天下午用红外电子体温计测大鼠的面温。3.1.2神经内分泌免疫系统指标检测神经递质：取各组脑组织用1.89％甲酸水溶液进行匀浆(组织/1.89％甲酸水溶液：g/10ml)，测定脑组织和血清中5-HT、GABA；内分泌指标：检测血清中皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)；免疫炎症指标：检测血清中免疫球蛋白M(IgM)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。3.2口腔溃疡评价灼伤48小后，观察口腔溃疡的大小、形状和颜色等，并用相机拍照，计算溃疡面积；组织病理观察：造模24h后，每组随机选取3只大鼠，经10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血处死后，暴露大鼠左右颊黏膜，切取6mm×4mm深达黏膜下层的黏膜组织，经无菌生理盐水冲洗后，置于4％多聚甲醛中固定，将标本进行石蜡包埋，制作切片后，观察组织病理表现；氧化应激和炎症指标检测：取各组口腔黏膜组织，经滤纸拭干后称重，制备10％组织匀浆(组织/生理盐水：1/9，m/m)，离心(4℃，5000rpm，10min)，取上清液分装，-80℃冷藏，按照试剂盒说明书测定上清液的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)。3.3数据处理数据采用均值±标准差表示，运用SPSS20.0进行单因素方差分析(ANOVA)和T检验分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于睡眠剥夺的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备口腔溃疡的动物模型：采用苯酚在大鼠侧颊粘膜处灼烧，造成白色损伤，24‑48小时后得到口腔溃疡动物模型；(2)建立睡眠剥夺型阴虚火旺证模型：将步骤1的动物模型置于睡眠剥夺装置内2‑7天；该装置是由一个鼠箱，内置若干个直径为4‑8cm，彼此间距为10‑20cm的平台组成；平台之间用水填充，平台高出水面约0.1‑2cm。
【技术特征摘要】
1.一种基于睡眠剥夺的阴虚火旺型口腔溃疡动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备口腔溃疡的动物模型：采用苯酚在大鼠侧颊粘膜处灼烧，造成白色损伤，24-48小时后得到口腔溃疡动物模型；(2)建立睡眠剥夺型阴虚火旺证模型：将步骤1的动物模型置于睡眠剥夺装置内2-7天；该装置是由一个鼠箱，内置若干个直径为4-8cm，彼此间距为10-20cm的平台组成；平台之间用水填充，平台高出水面约0.1-2cm。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述平台直径为6....
【专利技术属性】
技术研发人员：姚宏亮，谌攀，李沛波，苏薇薇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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