一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法技术

本发明专利技术公布了一种黑曲霉种子连续培养的方法，所述方法包括如下步骤：(1)启动阶段，将黑曲霉孢子接种至种子培养基，得到种子液；(2)种子连续培养阶段，对步骤(1)得到的种子液进行连续分散处理，分散得到的种子液进行连续培养，并同时补充新鲜种子补料培养基；(3)停止阶段，停止补充新鲜种子补料培养基和分散处理，继续培养得到种子液，移入发酵培养基进行发酵培养。本发明专利技术方法突破性解决了多细胞丝状菌生长缓慢，以及菌丝球在连续培养中容易流失的问题，完全实现了种子连续培养，使菌体恒定在最适的生长环境中，避免了菌种退化，使种子液处于连续稳定的高活力状态，对应发酵产柠檬酸的性能提高。

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法
本专利技术涉及微生物培养的
，尤其是涉及一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法。
技术介绍
柠檬酸是世界上生产量和使用量最大的有机酸，是一种重要的化工产品，具有广泛的用途。柠檬酸主要用于食品工业，如酸味剂、抗氧化剂、胶凝剂等，而且医药、饲料、化工、电子、纺织等工业领域都有十分广阔的应用，市场需求量逐年增加。我国是最大的柠檬酸生产和出口国，生产工艺先进，市场竞争力强，特别是独创以玉米、薯干等淀粉质原料的深层发酵指数居世界前列。虽然近年来生物发酵技术不断快速发展，新的发酵技术不断涌现，多种高效率的连续培养方式在不同发酵产品上得到广泛应用，但由于柠檬酸生产菌种黑曲霉是多核丝状真菌，其生长特性和菌体形态完全不同于酵母和细菌等单细胞微生物，以酵母和细菌为生产菌株的高效成熟的发酵方式并不能很好的应用于黑曲霉柠檬酸发酵生产中，严重制约了柠檬酸等以丝状菌作为生产菌株的发酵产业发展。当前，柠檬酸发酵生产仍然沿用传统的方式，即先制备大量的黑曲霉孢子；再将孢子接入种子培养基中培养获得成熟的种子液；然后将种子液移入发酵培养基中发酵得到柠檬酸发酵液。柠檬酸传统发酵方式存在以下问题：(1)黑曲霉孢子制备繁琐、周期长、效率低：黑曲霉菌种需要经过复壮，平板筛选和三级扩培，制备周期超过30天；人工操作繁琐，染菌风险大。(2)菌种稳定性、一致性差：当前孢子制备机械化程度低，麸曲培养容器小，在不同容器内一致性较差，导致种子培养质量和发酵结果不稳定。(3)种子培养效率低：孢子接种至种子培养需要8～12h的萌发时间，降低了种子罐的利用效率。(4)种子分批间歇培养不稳定：分批间歇培养中，菌体生长环境(如糖浓度、pH等)在不断变化，导致菌体生长无法长期处于最适的环境中。目前行业内还没有丝状菌的种子连续培养方法，原因在于丝状菌一般为多细胞，生长慢，成块、成球，在连续培养中细胞容易流失。常见的连续培养主要集中在细菌、酵母等种类的微生物方面，它们都是单细胞，形态简单，容易控制。专利CN201410329652.X公布了一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养的方法，虽然称为“连续”培养，但其本质为“循环”培养，该方法是将前一批剩余的分散菌丝接种至新的种子培养基培养成种子液来实现种子的循环培养。该方法虽然减少了孢子使用量和节省了孢子的萌发时间；但是种子需要在不同罐体内进行切换培养，设备系统增加，操作相对繁琐；而且每一批种子液仍然采用分批间歇培养的方式进行，培养环境在不断变化，无法保障种子在最适的环境条件下生长，不仅存在批次间的不稳定，更为重要的是容易导致菌种衰退，影响发酵水平。因此，目前行业内还没有产生真正的种子连续培养方法。相比专利CN201410329652.X中分批间歇培养，黑曲霉种子连续培养需要克服以下技术难点：(1)菌体生长慢；菌丝球容易流失；(2)减少菌种传代次数，避免菌体退化；(3)确定合适的种子液停留时间，避免菌体流失过快，同时保障移种种子液中菌体量充足，且保证培养环境稳定；(4)确定合适的菌丝大小，使菌体生长速率和稀释速率达到平衡。因此，如何突破多细胞丝状菌的局限，改进种子液制备过程，既能减少孢子使用量，提高种子培养效率，又能使种子的生长环境恒定在最适状态，培养环境根据菌体生长状态实时进行反馈调整，避免菌种退化，保证种子液质量稳定，提高发酵水平，是当前柠檬酸生产中亟待解决的一个问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种黑曲霉种子连续培养及其生产柠檬酸的方法。本专利技术方法突破性解决了多细胞丝状菌生长缓慢，以及菌丝球在连续培养中容易流失的问题，完全实现了种子连续培养，使菌体恒定在最适的生长环境中，避免了菌种退化，使种子液处于连续稳定的高活力状态，对应发酵指标显著提高。本专利技术的技术方案如下：一种黑曲霉种子连续培养的方法，所述方法包括如下步骤：(1)启动阶段：将黑曲霉孢子接种至种子培养基，培养16～36h，得到种子液；(2)种子连续培养阶段：对步骤(1)得到的种子液进行连续分散处理，分散得到的种子液进行连续培养，培养过程中种子液连续流出至发酵培养基进行发酵培养，同时以与流出种子液相同的速度补充新鲜种子补料培养基；(3)停止阶段：停止补充新鲜种子补料培养基和分散处理，继续培养得到种子液，之后将种子液移入发酵培养基进行发酵培养。步骤(1)中黑曲霉孢子接种后终浓度为1～9*105个/mL；步骤(1)中种子培养基的总糖为100～180g/L，C/N为20～40；步骤(1)中种子培养条件为：温度为35～39℃，风量为0.2～0.4vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm。步骤(2)中补充的新鲜种子补料培养基的总糖为150～200g/L，C/N为15-30；步骤(2)中连续培养条件为：温度为35～37℃，风量为0.3～0.6vvm，罐压为0.05～0.07Mpa，搅拌转速为150～200rpm。步骤(3)中继续培养的培养条件为：温度为35～39℃，风量为0.3～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为150～200rpm。步骤(2)中所述种子液连续分散处理的方法为：采用分散器将种子液中的菌丝球分散成10～80μm的絮状菌丝。步骤(2)中新鲜种子补料培养基补充速度和种子液流出的速度F＝V/t，其中V为种子罐内种子液体积，以不同罐体进行确定；t为种子液停留时间，根据絮状菌丝的细胞浓度反馈调节，通常取6-24h。步骤(2)、步骤(3)中发酵接种比例为5～25％(v/v)。步骤(2)、步骤(3)中发酵培养基的总糖为160～200g/L，C/N为50-90；步骤(2)、步骤(3)中发酵培养条件为：温度为35～39℃，风量为0.1～0.4vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm，还原糖浓度低于5g/L时结束发酵。所述种子培养基、新鲜种子补料培养基、发酵培养基分别为淀粉质原料液化液和氮源配制而成；所述淀粉质原料至少包括玉米粉、木薯粉、高粱粉、小麦淀粉其中一种；所述氮源至少包括硫酸铵、尿素、豆粕粉、玉米浆其中一种。一种生产柠檬酸的方法，该方法采用种子连续培养的方法所得的黑曲霉进行发酵，用于生产柠檬酸。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术方法完全实现了丝状菌的种子连续培养，相比专利CN201410329652.X，大幅度简化了设备系统，种子罐使用量减少至1/3；减少了操作步骤，显著提高生产效率，每批发酵罐对应的种子培养辅助时间节省12h；提高了种子培养自动化水平。本专利技术种子连续培养方法，相比专利CN201410329652.X，减少了菌种传代次数，能有效避免菌种退化，可以连续运行15天保持种子活力不下降，发酵指标稳定。高效率的连续运行不仅减少启停的辅助时间，而且黑曲霉孢子的使用量可以减少1/3，大幅降低黑曲霉孢子培养成本。本专利技术方法突出的优势是菌体恒定在最适的生长环境中，使种子始终处于连续稳定的高活力成熟状态，保证了种子液质量的稳定性和一致性。而专利CN201410329652.X中种子采用分批间歇培养，罐内pH不断下降和营养物质逐渐消耗，培养条件逐渐不利于菌体生长和活力保持，从而影响种子液质量，并且批次间种子液质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑曲霉种子连续培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)启动阶段：将黑曲霉孢子接种至种子培养基，培养16～36h，得到种子液；(2)种子连续培养阶段：对步骤(1)得到的种子液进行连续分散处理，分散得到的种子液进行连续培养，培养过程中种子液连续流出至发酵培养基进行发酵培养，同时以与流出种子液相同的速度补充新鲜种子补料培养基；(3)停止阶段：停止补充新鲜种子补料培养基和分散处理，继续培养得到种子液，之后将种子液移入发酵培养基进行发酵培养。

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉种子连续培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)启动阶段：将黑曲霉孢子接种至种子培养基，培养16～36h，得到种子液；(2)种子连续培养阶段：对步骤(1)得到的种子液进行连续分散处理，分散得到的种子液进行连续培养，培养过程中种子液连续流出至发酵培养基进行发酵培养，同时以与流出种子液相同的速度补充新鲜种子补料培养基；(3)停止阶段：停止补充新鲜种子补料培养基和分散处理，继续培养得到种子液，之后将种子液移入发酵培养基进行发酵培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中黑曲霉孢子接种后终浓度为1～9*105个/mL；步骤(1)中种子培养基的总糖为100～180g/L，C/N为20～40；步骤(1)中种子培养条件为：温度为35～39℃，风量为0.2～0.4vvm，罐压为0.05～0.1Mpa，搅拌转速为100～200rpm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中补充的新鲜种子补料培养基的总糖为150～200g/L，C/N为15-30；步骤(2)中连续培养条件为：温度为35～37℃，风量为0.3～0.6vvm，罐压为0.05～0.07Mpa，搅拌转速为150～200rpm。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中继续培养的培养条件为：温度为35～39℃，风量为0.3～0.6vvm，罐压为0.05～0.1Mp...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，胡志杰，李由然，蒋小东，金赛，孙福新，张成，周东姣，卢佳伟，苗茂栋，范子豪，
申请(专利权)人：江苏国信协联能源有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32