一种纯化重组α-淀粉酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化重组α‑淀粉酶的方法，构建α‑淀粉酶‑AcmA融合蛋白重组表达载体，α‑淀粉酶与AcmA锚定区之间添加凝血酶酶切位点，诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行分离纯化，并通过蛋白酶的特异裂解，得到不含任何标签的重组α‑淀粉酶。该方法能够利用简单易得的GEM将重组α‑淀粉酶的进行纯化，简化操作步骤，降低酶活损失，能够得到不含任何标签的重组酶，具有良好好的酶活和蛋白得率。这种方法能够简化纯化操作，降低酶活损失，通过特异性蛋白酶裂解，能够得到不含标签的重组酶。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化重组α-淀粉酶的方法
本专利技术涉及一种纯化重组α-淀粉酶的方法。
技术介绍
α-淀粉酶是一种淀粉水解酶，其可以催化水解淀粉中的α-1,4糖苷键。α-淀粉酶具有专一性和高效性，被广泛应用于工业催化等方面，如食品、纺织、医药、饲料等方面。芽孢杆菌可以作为淀粉酶的重要来源。大量的淀粉酶从芽孢杆菌中得到分离纯化，并被利用。本课题前期工作中分离筛选到一株产淀粉酶的解淀粉芽孢杆菌BH072，为了提高其淀粉酶产量，利用大肠杆菌进行α-淀粉酶的重组表达。乳酸乳球菌是一种安全级别(GRAS)的菌。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以特异的结合到乳酸乳球菌的细胞壁上，利用这个特性，通过酸煮沸手段去除乳酸乳球菌中大部分蛋白和DNA，得到了无生命的革兰氏阳性基质(Gram-positiveenhancermatrixparticles，GEM)。将蛋白与AcmA的重组融合，其可以特异的结合到GEM上。GEM锚定AcmA融合蛋白具有以下特点：具有良好的生物安全性、具有良好的机械性能和具有良好的蛋白特异结合能力。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种纯化重组α-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化重组α‑淀粉酶的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建α‑淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)利用凝血酶裂解融合蛋白；6)测定重组α‑淀粉酶在不同温度及pH下的酶活。

【技术特征摘要】
1.一种纯化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建α-淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)利用凝血酶裂解融合蛋白；6)测定重组α-淀粉酶在不同温度及pH下的酶活。2.根据权利要求1所述的一种纯化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤1)以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，并添加凝血酶酶切位点，扩增得到α-淀粉酶的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。3.根据权利要求1所述的一种纯化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤2)指划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.7时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-0.5mM，诱导温度选择为16℃-25℃，诱导时间为18小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。4.根据权利要求1所述的一种纯化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤3)指利用含1％葡萄糖的M17培养基培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志江，赵芳坤，杜仁鹏，韩烨，肖华志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12