痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示制造技术

本公开内容提供用于表达和展示处于自然构象的分离的整合膜蛋白(IMP)或其片段的组合物和方法，用于筛选、选择和鉴定与感兴趣的靶IMP结合的抗体或抗体样分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示专利技术人：E·S·史密斯(ErnestS.Smith)M·帕里斯(MarkParis)M·G·M·斯科瑞文斯(MariaG.M.Scrivens)R·A·柯克(ReneeA.Kirk)A·A·康尼尔森(AngelicaA.Moksa-Cornelison)
技术介绍
越来越多不同治疗应用中采用具有确定特异性的抗体。已有许多方法用以获得用于人类治疗应用的有用抗体。这些包括嵌合和人源化抗体，以及完全人抗体，其选自文库，例如，噬菌体展示文库，或来自转基因动物。细菌噬菌体中构建的免疫球蛋白文库可源自原初或特定免疫个体的产抗体细胞，并且原则上可包括人免疫球蛋白重链和轻链的新式且多样化的配对。尽管该策略不受制于固有库限制，它要求表达的免疫球蛋白片段的互补决定区(CDR)在细菌细胞中合成并正确折叠。然而，许多抗原结合区域难以在细菌细胞中正确组装为融合蛋白。此外，所述蛋白将不会经历正常的真核翻译后修饰。由此，该方法对可获得的抗体特异性施用不同的选择过滤条件。或者，完全人抗体可分离自真核系统中的文库，例如，酵母展示、逆转录病毒展示，或表达于DNA病毒如痘病毒中。参见例如，美国专利号7,858,559和美国专利申请公开号2013-028892，其通过引用其全文的方式纳入本文。用于治疗性抗体的许多重要靶标是整合膜蛋白(IMP)，例如，多次跨膜蛋白(GPCR，离子通道等)，其难以以构象完整状态进行表达和纯化。分离状态下正确折叠的靶蛋白的缺乏使得对于针对这些靶标的抗体的鉴定和选择成为挑战。尽管某些IMP可在细胞(例如，哺乳动物细胞)表面上表达，用于抗体发现的完整细胞是存在问题的，因为它们是复杂抗原混合物，靶标表达可能较低，还因为用以构建抗体文库(例如，牛痘病毒抗体文库)的某些展示包装物(displaypackage)可以非特异性方式结合至完整细胞。仍然需要用以表达并展示感兴趣的靶IMP的新方法，其中感兴趣的靶IMP处于其自然构象、具有足够浓度，且与其它细胞蛋白的竞争尽量地小，以允许从展示文库鉴定并选择治疗性抗体和抗体样分子。
技术实现思路
本公开内容提供用于表达和展示处于自然构象的分离的整合膜蛋白(IMP)或其片段的组合物和方法，用于筛选、选择和鉴定与感兴趣的靶IMP结合的抗体或抗体样分子。在某些实施方式中，本公开内容提供一种分离的多核苷酸，其包含：第一核酸片段，该第一核酸片段编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，其中该IMP或其片段包括至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3'端；和，第二核酸片段，该第二核酸片段编码牛痘病毒F13L蛋白或其功能性片段，其中该第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分。根据这些实施方式，包含所述多核苷酸的痘病毒感染的细胞可表达IMP-F13L融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜(outerenvelopemembrane)的部分。在某些方面中，F13L蛋白或其功能性片段可包括氨基酸序列SEQIDNO:1或其功能性片段。在一些方面中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。在一些方面中，IMP是表1中所列的多次跨膜蛋白。在一些方面中，多次跨膜的IMP可具有奇数个跨膜结构域，第一核酸片段的5'端可编码膜外区域，且第一核酸片段的3'端可编码与第二核酸片段的5'端融合的膜内区域。在一些方面中，该类型的第一核酸片段可编码，例如，G蛋白偶联受体(GPCR)。在一些方面中，GPCR可以是人卷曲-4蛋白(FZD4)或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括SEQIDNO:2的氨基酸20-892的多肽。在一些方面中，所述多肽还可包括信号肽，例如，SEQIDNO:2的氨基酸1-19。在一些方面中，GPCR可以是CXC趋化因子受体，例如，CXCR4，或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括氨基酸序列SEQIDNO:3的多肽。在一些方面中，多次跨膜的IMP可具有偶数个跨膜结构域，且第一核酸片段的5'和3'端均可编码膜内区域。在一些方面中，第二核酸片段可融合至第一核酸片段的3'端。在一些方面中，IMP可以是，例如，人CD20蛋白，或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括氨基酸序列SEQIDNO:4的多肽。在一些方面中，本文提供的多核苷酸的第一和第二核酸片段可直接融合。在一些方面中，本文提供的多核苷酸可包括第三核酸片段，其编码异源肽，例如，接头序列，氨基酸标签或标记物，或促进纯化的肽或多肽序列，例如组氨酸标签。在一些方面中，本文提供的多核苷酸能操作性地联合痘病毒启动子，例如，p7.5，T7，或H5启动子。本公开内容还提供由本文提供的多核苷酸编码的F13L融合蛋白。本公开内容还提供包括本文提供的多核苷酸的痘病毒基因组，例如，牛痘病毒基因组。本公开内容还提供包括本文提供的痘病毒基因组的重组牛痘病毒EEV。本公开内容还提供产生本文提供的重组牛痘病毒EEV的方法，所述方法包括：用包含本文提供的痘病毒基因组的牛痘病毒感染允许牛痘病毒感染的宿主细胞，和，回收由所述宿主细胞释放的EEV。本公开内容还提供展示处于自然构象的整合膜蛋白(IMP)或其片段的方法，其中，所述方法包括，用重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述重组痘病毒表达IMP或其片段，该IMP或其片段的形式为与痘病毒EEV特异性蛋白或其膜相关片段的融合蛋白，其中，由受感染的宿主细胞产生的EEV包含该IMP融合蛋白作为EEV包膜外膜的部分，和，回收由所述宿主细胞释放的EEV。在一些方面中，IMP或其片段以自然构象展示在EEV的表面。在一些方面中，EEV特异性蛋白可以是牛痘病毒A33R蛋白，A34R蛋白，A56R蛋白，B5R蛋白，A36R蛋白，F13L蛋白，其任何膜相关片段，或其任何组合。在一些方面中，EEV特异性蛋白是F13L(SEQIDNO:1)或其功能性片段。在一些方面中，IMP是多次跨膜蛋白，其包括至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。在一些方面中，IMP可以是G蛋白偶联受体(GPCR)，例如，如上所述的人FZD4或CXCR4，其包括7个跨膜结构域，并且F13L蛋白可融合至IMP的C末端。在一些方面中，IMP或其片段可具有偶数个跨膜结构域，例如，如上所述的人CD20，其中IMP或其片段的N末端和C末端均在膜内，并且F13L可融合至IMP的N末端或C末端。在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段可包括或由如下部分组成：牛痘病毒A56R蛋白的茎部、跨膜和膜内结构域，例如，SEQIDNO:5的氨基酸108-314。在一些方面中，A56R融合蛋白的IMP部分可包括人FZD4的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQIDNO:6的氨基酸20-370，人ErbB2(Her2)的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQIDNO:7的氨基酸20-855，或者，人CD100(轴突导向因子4D)的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQIDNO:8的氨基酸20-935。在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段可包括或由如下部分组成：牛痘病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多核苷酸，其包含：(a)第一核酸片段，其编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，其中IMP或其片段包含至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3'端；和(b)第二核酸片段，其编码牛痘病毒F13L蛋白或其功能性片段，其中第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分；其中，包含该多核苷酸的痘病毒感染的细胞能表达IMP‑F13L融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜的部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.22 US 62/326,5011.一种分离的多核苷酸，其包含：(a)第一核酸片段，其编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，其中IMP或其片段包含至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3'端；和(b)第二核酸片段，其编码牛痘病毒F13L蛋白或其功能性片段，其中第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分；其中，包含该多核苷酸的痘病毒感染的细胞能表达IMP-F13L融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜的部分。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，F13L蛋白或其功能性片段包含氨基酸序列SEQIDNO:1或其功能性片段。3.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中，IMP具有奇数个跨膜结构域，其中第一核酸片段的5'端编码膜外区域，其中第一核酸片段的3'端编码膜内区域，并且其中，第二多核苷酸的5'端融合至第一核酸片段的3'端。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中，IMP包含G蛋白偶联受体(GPCR)。6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中，IMP是人卷曲-4蛋白(FZD4)，或其片段。7.如权利要求6所述的多核苷酸，其编码包含SEQIDNO:2的氨基酸20-892的多肽。8.如权利要求7所述的多核苷酸，其还包含信号肽。9.如权利要求8所述的多核苷酸，其中，信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-19。10.如权利要求5所述的多核苷酸，其中，IMP是CXC趋化因子受体。11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，CXC趋化因子受体是CXCR4，或其片段。12.如权利要求11所述的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQIDNO:3的多肽。13.如权利要求3所述的多核苷酸，其中，IMP具有偶数个跨膜结构域，并且其中，第一核酸片段的5'和3'端编码膜内区域。14.如权利要求13所述的多核苷酸，其中，第二核酸片段融合至第一核酸片段的3'端。15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中，IMP是人CD20蛋白，或其片段。16.如权利要求15所述的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白质。17.如权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸，其中，第一和第二核酸片段是直接融合的。18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其还包含编码异源肽的第三核酸片段。19.如权利要求18所述的多核苷酸，其中，该异源肽包含接头序列、氨基酸标签或标记物，或促进纯化的肽或多肽序列。20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中，该异源肽包含组氨酸标签。21.如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸，其操作性地联合痘病毒启动子。22.如权利要求21所述的多核苷酸，其中，该痘病毒启动子是p7.5或H5或T7。23.由权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸编码的F13L融合蛋白。24.一种痘病毒基因组，其包含如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸。25.如权利要求24所述的痘病毒基因组，其为牛痘病毒基因组。26.一种重组牛痘病毒EEV，其包含如权利要求25所述的痘病毒基因组。27.一种产生如权利要求26所述的重组牛痘病毒EEV的方法，其包括：(a)用牛痘病毒感染允许牛痘病毒感染的宿主细胞，所述牛痘病毒包含如权利要求24所述的痘病毒基因组，和(b)回收由所述宿主细胞释放的EEV。28.一种展示处于自然构象的整合膜蛋白(IMP)或其片段的方法，其包括：(a)用重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述重组痘病毒表达IMP或其片段，该IMP或其片段为与痘病毒EEV特异性蛋白或其膜相关片段的融合蛋白形式，其中，由受感染的宿主细胞产生的EEV包含该IMP融合蛋白作为EEV包膜外膜的部分；(b)回收由所述宿主细胞释放的EEV其中，IMP或其片段以自然构象展示在EEV的表面上。29.如权利要求28所述的方法，其中，EEV特异性蛋白是牛痘病毒A33R蛋白，A34R蛋白，A56R蛋白，B5R蛋白，A36R蛋白，F13L蛋白，其任何膜相关片段，或其任何组合。30.如权利要求29所述的方法，其中，EEV特异性蛋白是F13L(SEQIDNO:1)或其功能性片段。31.如权利要求30所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。32.如权利要求31所述的方法，其中，IMP包含G蛋白偶联受体(GPCR)，其含有7个跨膜结构域，并且其中，F13L融合至IMP的C末端。33.如权利要求32所述的方法，其中，IMP是人卷曲-4蛋白(FZD4)，或其片段。34.如权利要求33所述的方法，其中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸20-892。35.如权利要求34所述的方法，其中，所述融合蛋白还包含信号肽。36.如权利要求35所述的方法，其中，所述信号肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-19。37.如权利要求32所述的方法，其中，IMP是CXC趋化因子受体。38.如权利要求37所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·S·史密斯，M·帕里斯，M·G·M·斯科瑞文斯，R·A·柯克，A·A·康尼尔森，
申请(专利权)人：瓦西尼斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US