一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用。该A群链球菌寡糖蛋白缀合物中，其寡糖抗原是明确且单一的寡聚体六糖或九糖衍生物，可通过化学方法合成；其连接臂为丁二酰亚胺；其使用的新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶。本发明专利技术还涉及上述A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法及其在制备抗A群链球菌疫苗中的应用。本发明专利技术所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物可以同时诱导出两类不同靶点的抗体协同针对A群链球菌，是一种复合型疫苗。这种疫苗具有更好的适用性，可以更有效的抑制A群链球菌，并且不受限于抗生素大量使用带来的细菌耐药性问题。

【技术实现步骤摘要】
一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用，属于抗A群链球菌疫苗研制

技术介绍
A群链球菌(GAS)是一种常见的革兰氏阳性病原菌，据统计，全球每年死于GAS感染疾病的人数约50万，其中80％是由GAS感染并发症引起的，主要以风湿性心脏病和侵略性GAS疾病为主(TheLancetInfectiousDiseases2005,5(11),685-694)。对于GAS感染引起的疾病，常见的治疗方式是使用抗生素干预，但随着细菌抗药性的不断增强，抗A群链球菌疫苗的研制对于GAS感染疾病的预防和治疗显得尤为重要。理想的抗A群链球菌疫苗应具备以下特点：(1)其抗原决定簇是保守性的，存在于所有的A群链球菌菌株中；(2)其具有高的免疫原性；(3)其可以很好的使人体产生强有力的免疫记忆，比如诱导血清免疫蛋白G(IgG)和粘膜免疫蛋白A(IgA)响应，同时又不会与人体组织发生交叉免疫反应(JournalofMolecularMedicine2012,90(10),1197–1207)。A群链球菌细胞壁表面多糖和其毒力因子C5a肽酶(ScpA)都是潜在的疫苗抗原靶标分子。由于细菌细胞表面多糖本身的免疫原性较低，以其为抗原开发疫苗的方式通常是将获得的糖链经过修饰后与具有免疫增强活性的载体蛋白共价结合来制备相应的糖蛋白缀合物。加拿大Pinto等人合成了包含二到六个糖基的寡糖抗原(Carbohydrateresearch1996,291,21-41)，与鸡卵清蛋白和牛血清蛋白共价缀合来制备相应寡糖缀合物(Bioorganic&MedicinalChemistry1996,4(11),2003-2010)，并研究了寡糖缀合物的免疫活性与寡糖半抗原结构间关系(CarbohydrateResearch2000,324(1),17-29)；诺华公司制备了六糖、十二糖寡糖半抗原并与破伤风类毒素共价缀合来制备寡糖缀合物(WO2012082635)，此寡糖缀合物在老鼠免疫实验中展现出良好的免疫活性(Vaccine2010,29,104-114)。但是，上述研究工作使用的载体蛋白为常见的载体蛋白，比如鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、破伤风类毒素等。目前已有研究报道使用上述载体蛋白制备的糖缀合物在免疫时可能产生一些不良效果，主要体现在抗原竞争和载体诱导抗原表位抑制两个方面(HumanVaccines&Immunotherapeutics2013,9(12),2505-2523)。当前，抗A群链球菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段，有许多问题函待解决。目前，以ScpA193为载体与GAS寡糖抗原连接制备抗A群链球菌寡糖缀合物疫苗，尚未见相关文献报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用，以失活的A群链球菌C5a肽酶ScpA193为载体，与A群链球菌寡糖抗原连接制备抗A群链球菌的寡糖蛋白缀合物，其中的寡糖抗原是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚衍生物。术语说明：室温：是指25±2℃。本专利技术通过如下的技术方案来实现：一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物，结构通式如式(I)所示：其中，GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物；连接臂为丁二酰亚胺；新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶，其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸，制备方法参照文献(RSCAdvance2017,7,42056-42063)；m为与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原数量，是1到30任意一个整数。根据本专利技术优选的，所述A群链球菌寡糖蛋白缀合物，结构通式如下：式(II)中，n是2或3，m是1到30任意一个整数。上述一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法，步骤如下：(1)GAS寡糖抗原的活化：将GAS寡糖抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的混合液，GAS寡糖抗原在混合液中的浓度为0.1～10mg/mL，搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯，双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原的摩尔当量比为10～15：1，室温搅拌4小时，减压蒸馏得白色粉末状固体，固体用乙酸乙酯洗涤，干燥后得活化的GAS寡糖抗原；(2)缀合物的合成：按照5～30：1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌过夜，透析法除去小分子物质，得糖蛋白缀合物水溶液，将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物。进一步优选的，所述寡聚体六糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。进一步优选的，所述寡聚体九糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述混合液中N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的体积比为4:1，其中，磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO40.1M，KH2PO40.1M，pH8。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶，其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸，制备方法参照文献(RSCAdvance2017,7,42056-42063)。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述活化的GAS寡糖抗原在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1～10mg/mL。其中，磷酸盐缓冲溶液的组分为Na2HPO40.1M，KH2PO40.1M，pH8。上述制备方法中涉及的药品均为普通市售产品，且未详细说明的步骤均按本领域常规操作进行。上述A群链球菌寡糖蛋白缀合物在制备抗A群链球菌疫苗中的应用。有益效果本专利技术制备的寡糖蛋白缀合物可以同时诱导出两类不同靶点的抗体协同针对A群链球菌，是一种复合型疫苗。这种疫苗具有更好的适用性，可以更有效的抑制A群链球菌，并且不受限于抗生素大量使用带来的细菌耐药性问题。附图说明图1是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖衍生物N2的1HNMR谱图；图2是A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体九糖衍生物N3的1HNMR谱图；图3是载体蛋白ScpA193、寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和寡糖蛋白缀合物N3-ScpA193的质谱图；图4是寡糖蛋白缀合物N2-ScpA193和N3-ScpA193的特异性抗体滴度图；图中纵坐标为抗体滴度，横坐标中IgM代表针对寡糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物，其特征在于，结构通式如式(I)所示：

【技术特征摘要】
1.一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物，其特征在于，结构通式如式(I)所示：其中，GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物；连接臂为丁二酰亚胺；新型载体蛋白ScpA193为定向突变失活的A群链球菌毒力因子C5a肽酶，其结构特征在于将193位的组氨酸突变为丙氨酸；m为与新型载体蛋白ScpA193连接的GAS寡糖抗原数量，是1到30任意一个整数。2.如权利要求1所述的A群链球菌寡糖蛋白缀合物，其特征在于，结构通式如下：式(II)中，n是2或3，m是1到30任意一个整数。3.权利要求1或2所述的一种A群链球菌寡糖蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)GAS寡糖抗原的活化：将GAS寡糖抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲溶液的混合液，GAS寡糖抗原在混合液中的浓度为0.1～10mg/mL，搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯，双琥珀酰亚胺戊二酸酯与GAS寡糖抗原的摩尔当量比为10～15：1，室温搅拌4小时，减压蒸馏得白色粉末状固体，固体用乙酸乙酯洗涤，干燥后得活化的GAS寡糖抗原；(2)缀合物的合成：按照5～30：1的摩尔比取活化的GAS寡糖抗原和新型载体蛋白ScpA193溶于磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌过夜，透析法除去小分子物质，得糖蛋白缀合物水溶液，将糖蛋白缀合物水溶液冻干得A群链球菌寡糖蛋白缀合物。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述GAS寡糖抗原为A群链球菌细胞壁表面多糖的寡聚体六糖或九糖衍生物。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述寡聚体六糖衍生物为3-氨基丙基α-L-吡喃...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾国锋，赵奕盛，郭忠武，王夙博，李辉，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37