cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法技术

本发明专利技术涉及cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法，可有效解决cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer的检测问题，分别制备胶体金标记用的、包被检测线用的抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体；分别制备抗cTnI、NT‑proBNP、D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，将胶体金标记物干燥、固化，将包被检测线用的抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、抗NT‑proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、抗D‑dimer蛋白质偶联物单克隆抗体至左向右依次分别包被于硝酸纤维膜上，成检测线，将抗鼠免疫球蛋白抗体包被于硝酸纤维膜上，成包被膜的质控线，即成。本发明专利技术工艺简单，新颖独特，能够快速简便、早期、有效诊断和鉴别各种急性胸痛。

【技术实现步骤摘要】
cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法
本专利技术涉及医学检验领域，特别是一种cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备方法。
技术介绍
cTnI：cTn（心肌肌钙蛋白）存在于心肌细胞中，由cTnI（心肌肌钙蛋白I）、cTnT（心肌肌钙蛋白T）和cTnC（心肌肌钙蛋白C）三种亚单位组成。cTnI和cTnT是心肌细胞特有的抗原。心肌细胞损伤后，血中出现cTnI、cTnT时间最早、持续时间长，cTnI、cTnT对心肌损伤具有很高的敏感度和特异性，并且cTnI较cTnT更敏感，其分子量为23000，心肌损伤后3～4小时cTnI升高，11～24小时达高峰，7～10天降至正常。cTnI现已取代其他早期心肌标志物成为诊断ACS（急性冠状动脉综合征）的首选心肌损伤标志物，尤其对于胸痛早期就诊患者，可更快速“诊断”和“排除”AMI（急性心肌梗死）。（按照冠脉病变严重程度ACS又分为AMI和UAP（不稳定型心绞痛）。）NT-proBNP：NP（利钠肽）家族是脊椎动物体内用于调节循环系统容量和渗透压的一大类物质。BNP（脑利钠肽）作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）、制备试纸条体：取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）、吸水棉浆板（5）自前向后依次粘贴于基材PVC板（1）上，在引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖前部覆盖膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖后部覆盖膜（6），切割成长条，即得cTnI、NT‑proBNP和D‑dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条体；（2）制备单克隆抗体：按体积计，分别取1份含有第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹...

【技术特征摘要】
1.一种cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备，其特征在于，包括以下步骤：（1）、制备试纸条体：取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）、吸水棉浆板（5）自前向后依次粘贴于基材PVC板（1）上，在引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖前部覆盖膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖后部覆盖膜（6），切割成长条，即得cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条体；（2）制备单克隆抗体：按体积计，分别取1份含有第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水和第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水，与2份60mM醋酸缓冲液混合，18～25℃搅拌下逐滴加入辛酸，每1mL小鼠腹水中加入30~35μL辛酸，混匀后，室温放置28~32分钟，13000~17000转/分、4℃离心18~22分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调pH值至7.0~7.5，再加入硫酸铵，每1mL上清液中加入0.3-0.4g硫酸铵，快速使硫酸铵溶解，18～25℃搅拌28~32分钟，13000~17000转/分、4℃离心18~22分钟、弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的pH7.2的0.01MPBS溶液溶解，再放入pH7.2的0.01MPBS溶液中浸没，4℃透析45~50小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即分别得胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体；所述小鼠腹水是，将液体石蜡注射入6～8周龄BALB/C小鼠腹腔内，注射量为800～1000μL/只，2～3周后，将分泌第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、分泌第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗1的杂交瘤细胞、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞、第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106个/只鼠，10～15天后用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，即得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水和第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；（3）制备待标记的胶体金溶液：将800~1200mL蒸馏水，100℃煮沸3~7分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液8~12mL和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液13～20mL，搅拌至溶液呈深红色，冷却至18～25℃，K2CO3调pH值至待标记单克隆抗体的等电点或偏碱性，即为待标记的胶体金溶液；（4）制备胶体金标记物：取80~120mL步骤（2）制得的待标记的胶体金溶液3份，分别加入80~1200μg步骤（1）制得的胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体，搅拌1~3分钟，再加入质量浓度为10％的BSA溶液终止反应，加入量为每mL溶液加入BSA溶液13~17μL，13000-17000r/min离心45~55分钟，得沉淀物，沉淀物用pH7.4、0.01MPBS溶液稀释至步骤（3）制得的待标记的胶体金溶液体积的20～40％，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；（5）制备固化胶体金标记物：用载体玻璃纤维分别吸取步骤（4）制得的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物和第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物和第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物；（6）包被试纸条体：取步骤（2）制得的包被检测线用的第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体，自左向右依次分别包被于硝酸纤维膜上，制备成第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2-1、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2-2、第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的检测线2-3，将抗鼠免疫球蛋白抗体包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜的质控线2-4，即成胸痛三联胶体金免疫试纸条，所述的抗鼠免疫球蛋白抗体的包被浓度为0.4～6mg/mL，第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的包被浓度均为0.03～3mg/mL，即成。2.根据权利要求1所述的cTnI、NT-proBNP和D-dimer胸痛三联胶体金免疫试纸条的制备，其特征在于：所述的制备单克隆抗体：按体积计：分各取1份含有第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水和第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水，与2份60mM醋酸缓冲液混合，18℃室温搅拌下逐滴加入辛酸，每1mL小鼠腹水中加入30μL辛酸，混匀后，室温放置28分钟，13000转/分、4℃离心22分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调pH值至7.0，再加入硫酸铵，每1mL上清液中加入0.3g硫酸铵，快速使硫酸铵溶解，18℃搅拌32分钟，13000转/分、4℃离心22分钟、弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的pH7.2的0.01MPBS溶液溶解，再放入pH7.2的0.01MPBS溶液中浸没，4℃透析45小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即得胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体、包被检测线用的第二抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体；所述的制备待标记的胶体金溶液：将800mL蒸馏水，100℃煮沸3分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液8mL和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液13mL，搅拌至溶液呈深红色，冷却至18℃，K2CO3调pH值至待标记单克隆抗体的等电点，即为待标记的胶体金溶液；所述的制备胶体金标记物：取80mL待标记的胶体金溶液3份，分别加入80μg胶体金标记用的第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体、胶体金标记用的第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体，搅拌1分钟，再加入质量浓度为10％的BSA溶液终止反应，加入量为每mL溶液加入BSA溶液13μL，13000-17000r/min离心45~55分钟，得沉淀物，取沉淀物用pH7.4，0.01MPBS溶液稀释至待标记的胶体金溶液体积的20％，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；所述的制备固化胶体金标记物：用载体玻璃纤维分别吸取第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物、第一抗NT-proBNP蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物和第一抗D-dimer蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制得第一抗cTnI蛋白质偶联物单克隆抗体固化胶体金标记物、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽，王玉金，杨书豪，杜迅，何蔚荭，安明理，李珊珊，周伏忠，胡宜亮，陈国参，孙晨阳，
申请(专利权)人：河南省科学院生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南,41