用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记制造技术

本发明专利技术公开了一种用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记及其用途，该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQ ID NO：1‑2、SEQ ID NO：3‑4、SEQ ID NO：5‑6。利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过本发明专利技术的标记引物检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生。

【技术实现步骤摘要】
用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种用于大豆杂交育种的不育基因鉴定方法。
技术介绍
大豆育性主要分为三种类型，雌雄均不育、雄性不育雌性可育、质核互作不育。雌雄均不育因不能获得后代在大豆育种中应用意义不大，质核互作不育和雄性不育可在在大豆杂种优势利用中发挥重要的作用。到目前为止，已发现12个雄性不育雌性可育基因，Gm02中含有4个，分别为ms3、ms4、msMOS、msp；Gm03中ms9基因；Gm07中含有ms8基因；Gm09中含有ms7基因；Gm10中含有ms2基因；Gm11中含有ms5基因；Gm13中含有三个不育基因，分别为ms1、ms6、st5。大豆杂交种可以提高大豆产量，研究表明，大豆产量优势可超双亲平均的42%。大豆是一种自花授粉作物，如果想获得杂交种子，需要进行人工杂交，此方法不仅费时费力，而且不可能获得大量的杂交种子，如果大豆是雄性不育、雌性可育则可省去了人工去雄步骤，使获得大量杂交种子成为可能。专利技术人团队开发了一种新的大豆雄性不育（花粉型）基因mst-M，将其用于大豆雄性不育系的构建和杂交种子的育种工作，并进一步开发了上述不育基因的三对标记引物，用于在不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，早期判断材料育性，提前去除可育株，以便获得更多杂交后代。。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供大豆雄性不育基因的标记引物，用于在雄性不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，提前去除可育株，以便获得更多杂交后代。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记，该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQIDNO：1-2、SEQIDNO：3-4、SEQIDNO：5-6。上述标记的用途，利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过上述标记引物检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生；所述不育基因为大豆雄性不育基因mst-M。上述标记的开发方法包含如下步骤：A、对大豆可育和选定的不育材料样本进行全基因组重测序；B、在步骤A的基础上，以公共大豆基因组为参考基因组，在SNP富集区进行SNP位点的预测，选取测序深度＞10且测序质量高的位点，将该位点上下游一定长度的序列以wildtypeWT和MutanttypeMT的形式列出；C、对于步骤B选取的位点：C-1、首先预测该位点是否能够引起酶切位点的出现或缺失，如何能够引起变异，即在该位点上下游各150bp左右设计上下游引物形成CAPs标记引物进行利用；C-2、如果SNP位点不直接引起酶切位点的变异，在设计引物时，对SNP位点相邻的1-2个碱基引入突变，引入突变后仅使WT或MT其中之一产生一种类型的酶切位点，而保证另外一种没有，且引起变异引物的长度控制在25-40bp之间，使得PCR产物长度在150bp-250bp之间。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤B中，所述公共大豆基因组选用Wm82.a2.v1基因组。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤B中，将所选取位点上下游各30或29bp的序列以wildtypeWT和MutanttypeMT的形式列出。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：通过雄性不育系获得大豆杂交种子，与人工授粉相比节省了大量的劳动力，具有明显的优势。雄性不育系的鉴定（及雄性可育系提出）一般需要在大豆生殖成熟之前，否则将导致杂交的失败。本专利的专利技术人团队开发了一种新的大豆雄性不育（花粉型）基因mst-M，将其用于大豆雄性不育系的构建及杂交种子的育种工作，并进一步开发了上述不育基因的三对标记引物，用于在不育系出苗后鉴定后者是否稳定携带有不育基因，避免大豆成熟后杂交授粉的失败。附图说明图1：不育突变体植株和花粉表型。a,b图分别是可育和不育单株在R7时期表型；c,d图分别是可育和不育植株花粉经由碘化钾染色后在100倍显微镜下的表型；e,f图分别是可育和不育植株花粉在扫描电镜下表型。图2：不育和可育单株花粉个数与直径。a图是可育和不育植株的单个花中含有花粉粒的个数；b图表示可育和不育植株花粉的直径。图3：近等基因系间变异分析.将染色体上SNP和Indel变异数目利用颜色进行表示，颜色越深表示单位长度内变异越多。图4：不育基因遗传定位和图谱整合.1,2分别是ms1和ms6的遗传图谱(Yangetal.2014)；3是st5的遗传图谱(Spethetal.2015)；4是本研究中mst-M的遗传图谱;Integrated-map-F是将已有研究结果根据标记进行整合后的遗传图谱。具体实施方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。本专利技术涉及的实验方法均为常规试验方法，包括：碘化钾染色方法；扫描电镜方法，花粉数目统计方法，花粉直径统计方法；遗传分析计算方法；重测序方法描述；Joinmap构建遗传图谱方法；dCAPs标记开发方法，SSR标记方法，dCAPs方法。实施例1、大豆不育植株表型鉴定。对田间发现的不育材料，命名为St-M，进行观察发现，结果发现在苗期（V1）至初荚期（R3）不育材料与可育材料表型无显著差异；但在R4时期不育植株荚的发育出现停滞，并且整个植株生育阶段持续维持在R3-R4时期，直至植株死亡（图1，a-b）。由于St-M在R3时期可以形成荚，表明St-M的雌蕊正常，因此推测不育可能是由于花粉败育引起。为进一步证明此推论，利用碘化钾染色和扫描电镜两种方法对St-M花苞状态的花粉进行观察，结果显示（图1，c-f）St-M的花粉粒不能被正常着色，而对照可育植株则可以被正常染色，结果表明St-M的花粉出现异常；为细致观察异常花粉外观形态，利用扫描电镜进行观察，发现正常花粉在电镜下呈现饱满圆润的状态，而不育的花粉则出现皱缩、干瘪的形态，初步判断St-M的花粉形态异常。此外，在对St-M的花粉进行观察的时候发现不育植株花粉粒数偏少，单个花粉直径偏大，为进一步量化二则差异，对花粉粒数和直径进行统计。结果显示(图2)，正常可育花的花粉粒数在580个左右，直径在24微米左右，而St-M的单个花苞的花粉粒数仅为150个左右，约为正常花的1/4，直径在40微米左右，为正常花粉粒的2倍左右，结果表明St-M在花粉粒数和直径上均出现了异常。实施例2、大豆不育性状的遗传分析。为进一步分析大豆不育突变体St-M的不育类型，利用正反交和回交的方法分析雌蕊，花粉及细胞质对育性的影响。JD12为正常可育品种，利用人工去雄授粉的方式将JD12与突变体St-M进行正反交实验。结果显示，以St-M为母本，JD12为父本，对共计252朵进行独立去雄和授粉试验，最终获得32个果荚，杂交成功率为12.7%；同时以JD12为母本进行杂交试验，共对339朵进行去雄和授粉试验，未获得果荚。结果表明（见下表），St-M雌蕊正常，花粉败育。与花粉观察结果一致。S-M（♂）JD12（♂）F1#(♂）St-M（♀）-32/252JD12（♀）0/339-22/243注：♀表示母本，♂表示父本，F1为St-M♀×JD12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记，其特征在于：该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQ ID NO：1‑2、SEQ ID NO：3‑4、SEQ ID NO：5‑6。

【技术特征摘要】
1.用于大豆不育基因的稳定紧密连锁标记，其特征在于：该标记包含如下三组核苷酸序列对：SEQIDNO：1-2、SEQIDNO：3-4、SEQIDNO：5-6。2.权利要求1所述标记的用途，利用含有不育基因的转基因大豆植株构建雄性不育系，然后利用此雄性不育系培育杂交大豆以获得具有杂种优势的大豆植株；其特征在于：在上述培育过程中，当大豆雄性不育系出苗后通过权利要求1所述的标记检测大豆是否稳定含有所述不育基因，从而确保大豆成熟后杂交授粉的成功发生。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述不育基因为大豆雄性不育基因mst-M。4.权利要求1所述标记的开发方法，其特征在于：该方法包含如下步骤：A、对大豆可育和选定的不育材料样本进行全基因组重测序；B、在步骤A的基础上，以公共大豆基因组为参考基因组，在SNP富集区进行SNP位点的预测，选取测序深度＞10且测序质量高的位点，将该位点上下...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春燕，杨永庆，张孟臣，赵青松，闫龙，陈强，赵鑫，王凤敏，邸锐，冯燕，
申请(专利权)人：河北省农林科学院粮油作物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13