一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗的制备与应用。所述疫苗以猪圆环病毒3型Cap蛋白与筛选的猪圆环病毒2型和1型Cap蛋白B细胞及T细胞表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、制剂等工艺，获得具有理想免疫原性的猪圆环病毒三价亚单位疫苗。动物实验表明，猪圆环病毒三价亚单位疫苗不仅安全性良好，而且能够激发有效的体液免疫与细胞免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
本专利技术属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将猪圆环病毒3型Cap蛋白与筛选的猪圆环病毒2型和1型Cap蛋白B细胞及T细胞表位串联并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、制剂等工艺，得到一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗以及该疫苗在预防猪圆环病毒导致的多种疾病中的应用。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircoviruses，PCV)是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirusassociateddiseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎，猪皮炎和肾病终合症和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，它是影响生猪产业的最具破坏性的疾病之一，并在全球范围内造成重大经济损失。2016年发现了一种新的猪圆环病毒，猪圆环病毒3型(PCV3)。第一次记录的事件发生在美国2至3周和9至10周的猪中，这些猪具有多系统炎症和未确定病因的心脏病理病征，临床表现为感染仔猪消瘦、关节肿胀、呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍等。在猪皮炎和肾病综合征(PDNS)的母猪以及从这些母猪中流产的木乃伊胎儿中也检测到PCV3。此外，在48份存档的PDNS组织样本中的45份中发现PCV3，并且通过实时PCR(qPCR)在从呼吸疾病病例收集的271份样品中的34份中检测到PCV3。在中国，PCV3在呼吸道疾病和发热的小猪中检测到，这些仔猪对PCV2，猪生殖和呼吸综合征病毒以及奥耶斯基病病毒也呈阴性。此外，巴西、波兰、德国、韩国、泰国、英国等国家的流行病学研究也发现了猪圆环病毒3型。PCV3可以从不同的猪组织中检测得出，死胎和精液样本中的PCV3阳性检测结果表明PCV3具有垂直传播的风险。基因组序列分析发现PCV3基因组包含2000碱基，具有与PCV1和PCV2相似的基因组结构，主要编码Cap和Rep两个基因。Cap基因编码214个氨基酸残基，较PCV2少19～20个，此外，PCV2和鸭圆环病毒相比，相似性仅为36～37％。专利技术概述本专利技术以猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守Cap蛋白、猪圆环病毒2型的B细胞表位和猪圆环病毒1型的T细胞表位作为疫苗结构，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、制剂等工艺，获得具有理想免疫原性的猪圆环病毒三价亚单位疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效体液免疫和细胞免疫反应。本专利技术的目的之一在于提供了一种新的能够激发体液免疫、细胞免疫的猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽及其疫苗组合物，疫苗组合物可用于预防猪圆环病毒引发的相关疾病；本专利技术的目的之二在于提供了所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的构建及获得方法；本专利技术的目的之三在于提供了能够表达所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的基因工程菌株；本专利技术的目的之四在于提供了所述猪圆环病毒三价亚单位疫苗的制备方法；本专利技术的目的之五在于提供了所述圆环病毒三价亚单位疫苗在预防猪圆环病毒病中的用途。在第一方面，本专利技术提供了一种用于预防的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽及其组合物。其含有猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守Cap蛋白、猪圆环病毒2型的B细胞表位和猪圆环病毒1型的T细胞表位。B细胞表位、T细胞表位是指具有免疫原性的主要核衣壳蛋白中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性功能的等价物。串联可以通过遗传工程方法或人工合成进行，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗中除了含有主要核衣壳蛋白抗原表位，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有核衣壳蛋白抗原免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。优选在本专利技术第一方面的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽中所述的主要核衣壳蛋白抗原及其表位序列分别选自猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守Cap蛋白、猪圆环病毒2型的B细胞表位和猪圆环病毒1型的T细胞表位。另外优选，本专利技术第一方面所述重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽的氨基酸序列如下：(1)猪圆环病毒3型不同流行毒株的共有保守Cap蛋白(SEQIDNo.4)：(2)猪圆环病毒2型的B细胞表位1氨基酸序列为Be1(SEQIDNo.6)：VDMMRFNINDFLPPGGGSNP；(3)猪圆环病毒2型的B细胞表位2氨基酸序列为Be2(SEQIDNo.8)：VPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGV；(4)猪圆环病毒2型的B细胞表位3氨基酸序列为Be3(SEQIDNo.10)：(5)猪圆环病毒2型的B细胞表位4氨基酸序列为Be4(SEQIDNo.12)：TMYVQFREFNLKDPPLNP；(6)猪圆环病毒1型的T细胞表位1氨基酸序列为Te1(SEQIDNo.14)：PYLAHPAFRNRYRWRRKTGIFNGSGEFVLTIK(7)猪圆环病毒1型的T细胞表位2氨基酸序列为Te2(SEQIDNo.16)：(8)猪圆环病毒1型的T细胞表位3氨基酸序列为Te3(SEQIDNo.18)：(9)猪圆环病毒1型的T细胞表位4氨基酸序列为Te4(SEQIDNo.120)：基于疫苗激发免疫反应机理和疫苗本身生物化学特性考虑，更佳的肽片段组合次序为：PCV3Cap-PCV2Be1-PCV2Be2-PCV2Be3-PCV2Be4-PCV1Te1-PCV1Te2-PCV1Te3-PCV1Te4。因此，重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽氨基酸序列如下：在第二方面，本专利技术提供了一种核苷酸分子，其编码本专利技术第一方面所述的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽。本专利技术中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗多肽。在本专利技术中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本专利技术中的核苷酸序列如下：注：方框内为酶切位点。在第三方面，本专利技术提供了一种载体，其除了含有本专利技术第二方面所述的编码重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。本专利技术中优选pRSETB作为目的基因的表达载体。在第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其含有本专利技术第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本专利技术所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的重组猪圆环病毒三价亚单位疫苗抗原。本专利技术中优选大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNo.2。2.一种核酸分子，其编码权利要求1项所述融合蛋白，其具体核苷酸序列为SEQIDNo.1。3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李殿明，齐春梅，蒲勤，田春辉，刘甜甜，任百亮，张导春，张晓丹，吴启凡，党将将，
申请(专利权)人：青岛明勤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37