一种基因碱基编辑器制造技术

本发明专利技术提供的人源载脂蛋白B信使RNA脱氨酶催化亚基3A(APOBEC3A)、CRISPR相关Cas蛋白以及尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)[视情况而定加与不加]的融合表达的蛋白(碱基编辑器)。该碱基编辑器能够在DNA中进行碱基编辑，将胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，即使胞嘧啶位于GpC位点或者高甲基化状态下，该碱基编辑器仍然具有较高的编辑效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基因碱基编辑器
本专利技术涉及一种基因碱基编辑器。
技术介绍
基因组编辑技术指利用可设计的核酸酶(分子剪刀)通过碱基插入、缺失或置换等方式，对生物体基因组DNA特定片段进行改造从而达到对目标基因进行编辑的一种基因工程技术。利用基因组编辑技术对细胞进行遗传学操纵，可广泛的应用于生命科学基础研究、生物技术开发、农业技术开发以及医药研发领域。例如：直接在体内校正引起遗传疾病的基因突变，将能够从根本上治疗遗传疾病；对农作物进行精确的基因工程改造，使其产量提高或能够抵抗环境污染或病原体的感染；对微生物基因组进行精准改造，从而促进可再生生物能源的开发等。CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein)基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并且是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。Cas核酸酶利用引导RNA(guideRNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(doublestrandbreaks，DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，基因组编辑将会导致基因的失活或者突变的校正。通常来说，有两种主要的修复机制会被DSB所激活，一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)，另一种是同源性介导修复(homology-directedrepair，HDR)。作为DNA双链断裂最主要的修复通路，NHEJ在修复过程中能在DSB附近的基因组位点引入随机性碱基插入或缺失，从而导致基因的失活。与NHEJ相反，当HDR被激活时能够以外源性供体DNA作为模版，利用同源重组机制将外源性供体DNA的序列替换靶点基因组DNA的序列，从而完成基因突变的校正。但实际上，由于同源重组机制本身的局限性，HDR介导的基因校正效率一直很低(通常小于5％)。因此，极大限制了CRISPR/Cas基因组编辑工具从科研向应用的转化，尤其是在精准基因治疗方面的应用，这也是基因编辑领域的一大难题。为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(baseeditor，BE)在近期内应运而生。现有的碱基编辑器将CRISPR/Cas系统和大鼠胞嘧啶脱氨酶1(ratAPOBEC1，rA1)整合在一起，可执行将胞嘧啶(cytosine，C)编辑为胸腺嘧啶(thymine，T)的功能。然而，基于rA1的碱基编辑器无法有效编辑GpC位点中的碱基C，从而限制了现有碱基编辑器的有效编辑位点。例如，GpT至GpC的突变可导致RNA剪接位点的缺失，从而引发多种人类疾病；而现有的基于rA1的碱基编辑器则无法有效的矫正GpT至GpC的突变。因此，创造能够在GpC位点进行高效碱基编辑的新型碱基编辑器，有助于在各物种基因组更为广泛的位点实现高效的碱基编辑，并极大地扩充我们对于碱基编辑器的应用，特别是在医疗领域对相关疾病进行精准基因治疗方面。
技术实现思路
本专利技术公开了一系列新型碱基编辑器(融合蛋白)和相应的新的基因碱基编辑方法。该专利技术显示，通过将人胞嘧啶脱氨酶3A(humanAPOBEC3A，hA3A)与CRISPR/Cas系统融合，能够在CRISPR/Cas系统的靶标位点高效地将胞嘧啶(C)脱氨基成尿嘧啶(U)，从而导致基因组中特定位点上C到T的突变。当融合蛋白中同时融合了尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)时，该系列碱基编辑器的编辑效率能够进一步提高。惊喜的是，即使是在GpC二核苷酸的背景下，该系列编辑器仍然能够实现高精度、高效率的定向碱基编辑。特别值得注意的是，该系列编辑器也能够在甲基化的胞嘧啶(methylatedC)上进行高效率的编辑，由于胞嘧啶甲基化在活细胞中普遍而常见，所以该系列编辑器在甲基化胞嘧啶上的高编辑效率无疑具有显著的临床意义。相应地，在本专利技术公开的实施例中，本专利技术公开了一种碱基编辑器，其包含有两个片段，第一片段包含载脂蛋白B人胞嘧啶脱氨酶3A(humanAPOBEC3A，hA3A)，第二片段包含CRISPR/Cas系统相关蛋白。在其他的一些实施例中，融合蛋白还将进一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。该系列基因碱基编辑器的大小分别不超过3000,2500,2200,2100,2000,1900,1800,1700,1600,或1500个氨基酸。在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的APOBEC3A部分包含来自于SEQIDNO：1的氨基酸序列，或者与SEQIDNO：1的氨基酸残基的29-199位具有至少90％的序列同一性并保留胞苷脱氨酶活性。在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的APOBEC3A部分包含选自SEQIDNO：1-10的氨基酸序列。在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的Cas蛋白部分来自于以下组群SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpff1，LbCpff1，FnCpff1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9；在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的Cas蛋白部分是上述Cas蛋白组群(SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpff1，LbCpf1，FnCpf1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9)中某些蛋白的突变体，其保留了这些Cas蛋白的DNA结合活性，但完全丧失了DNA剪切活性；在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的Cas蛋白部分是上述Cas蛋白组群(SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpff1，LbCpff1，FnCpff1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9)中某些蛋白的突变体，其保留了这些Cas蛋白的DNA结合活性，但丧失了部分DNA剪切活性(即只能切割基因组双链DNA中的一条链)；在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的Cas蛋白部分包含如SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器的UGI部分包含如SEQIDNO：12所示的氨基酸序列，或者与SEQIDNO：12列出的氨基酸序列具有至少90％的序列抑制同一性并保留尿嘧啶糖基化酶活性的功能。在一些实施例中，第一片段位于第二片段的N端侧；在一些实施例中，第一片段位于第二片段的N端侧，第二片段位于UGI片段的N端侧。在一些实施例中，该系列基因碱基编辑器(融合蛋白)在第一片段与第二片段之间进一步包含长短不一的连接肽；在一些实施例中，该连接肽具有1至100个氨基酸残基；在一些实施例中，该连接肽的氨基酸残基序列中至少有10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸，甘氨酸，半胱氨酸和丝氨酸；在一些实施例中，该连接肽具有如SEQIDNO：13或14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白包括两个组分。第一个片段是人源载脂蛋白B信使RNA脱氨酶催化亚基3A(APOBEC3A)，第二个片段是CRISPR相关(Cas)蛋白‑Cas9。

【技术特征摘要】
2018.02.23 CN PCT/CN2018/0769911.融合蛋白包括两个组分。第一个片段是人源载脂蛋白B信使RNA脱氨酶催化亚基3A(APOBEC3A)，第二个片段是CRISPR相关(Cas)蛋白-Cas9。2.权利要求1中的融合蛋白包含一个尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)。3.权利要求1中的融合蛋白的大小不超过2500个氨基酸。4.权利要求1中的融合蛋白中的APOBEC3A包含来自于SEQIDNO：1的氨基酸序列，或者与SEQIDNO：1的氨基酸残基的29-199位具有至少90％的序列同一性并保留胞苷脱氨酶活性。5.权利要求4中的融合蛋白中的APOBEC3A包含选自SEQIDNO：1-10的氨基酸序列。6.权利要求1中的融合蛋白中的Cas蛋白来自于以下组群SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpf1，LbCpf1，FnCpf1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9。7.权利要求1中的融合蛋白中的Cas蛋白是Cas蛋白组群(SpCas9，FnCas9，St1Cas9，St3Cas9，NmCas9，SaCas9，AsCpf1，LbCpf1，FnCpf1，VQRSpCas9，EQRSpCas9，VRERSpCas9，RHAFnCas9，以及KKHSaCas9)中某些蛋白的突变体，其保留了这些Cas蛋白的DNA结合活性，但不产生DNA双链断裂。8.权利要求7中的融合蛋白的组分Cas蛋白的突变体能够在其结合的DNA双链的一条链上引入一个缺口。9.权利要求7中的融合蛋白的组分Cas蛋白包含如SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。10.在权利要求1融合蛋白中，第一片段位于第二片段的N端侧。11.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳，杨力，黄行许，杨贝，王潇，李佳楠，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31