一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其是使用cfDNA多基因变异结合机器学习来判定，包括对肺结节患者外周血cfDNA进行文库构建，并采用肺癌相关18个基因捕获探针对cfDNA进行杂交捕获，使用测序仪进行测序，分析每个基因的累计突变频率，使用逻辑回归的模型判断样本的良恶性。本发明专利技术能够高灵敏度、高特异性的区分肺部结节患者的良恶性，避免了人工读取CT影像学的经验错误，避免了肺癌的漏检以及良性结节患者穿刺或者手术取样活检的痛苦。

【技术实现步骤摘要】
一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法
本专利技术涉及基因检测、生物信息学、数学建模等领域，具体涉及一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法。
技术介绍
肺癌是严重危害人类健康的疾病，WHO公布的资料显示，肺癌无论是发病率还是病死率均居全球癌症首位。最近中国肿瘤中心公布的中国肿瘤年发病人数为429.16万例(男251.21万例，女177.95万例)，其中肺癌年发病人数为73.33万例(男50.93万例，女22.40万例)，年病死人数为61.02万例(男43.24万例，女17.78万例)，也均居中国肿瘤之首(Chenetal.,2016)。此外，由于诊断偏晚，我国肺癌5年存活率仅为15.6％。要改善肺癌预后，也急需要提高早期肺癌(这里将原位癌和Ia期期肺癌称为早期肺癌(下同)诊断率。最佳策略为将诊断肺癌端口迁移至诊断肺结节，从而尽可能早地诊断和治疗早期肺癌。许多患者等有了肿瘤临床症状才进行检查，此时已经过了最佳治疗时间。而且目前对于早期肺癌的诊断还没有一种灵敏度、特异性高，安全无创的早期诊断筛查方法。因此对于肺癌的早期诊断非常需要一种创新性的无创检测技术和手段。当前在肺结节的诊断中，主要以CT影像学资料，结合医生个人经验去初步判断良恶性，然后通过长时间随访以及支气管镜或者穿刺活检来确诊良恶性。该方法由于医生经验限制，准确性波动比较大，存在大量过度检测和漏检的状况。液体活检作为体外诊断的一个分支,是指一种非侵入式的血液测试,能监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片,是检测肿瘤和癌症、辅助治疗的突破性技术。目前，在液体活检领域已经有许多分子水平标记物进入研发，如蛋白表达量变化(Ma&Xu,2017)，miRNA(Mo,Chen,Fu,Wang,&Fu,2012)，cfDNA甲基化(Zhangetal.,2011)，cfDNA水平(Szpechcinskietal.,2015)，血小板RNA(Bestetal.,2015)等。研究表明，在癌症患者中，循环游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)中含有微量的循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)。ctDNA的变异来自于癌细胞，与肿瘤组织具有高度一致性，因而它可以替代肿瘤组织，作为检测和诊断肿瘤的指标和依据以及成为早期癌症筛查的重要工具。液体活检只需抽取10mL外周血，对患者无创伤，而且更为简便、灵敏。
技术实现思路
为了找到更好的肺结节良恶性判断方法，本专利技术公开了一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其能够实现高灵敏度、高特异性的区分肺部结节患者的良恶性，避免了人工读取CT影像学的经验错误，避免了肺癌的漏检以及良性结节患者穿刺或者手术取样活检的痛苦。所采用的技术方案如下：一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其是使用cfDNA多基因变异结合机器学习来判定，包括如下步骤：S1.对肺结节患者外周血cfDNA进行文库构建；S2.采用肺癌相关18个基因捕获探针对cfDNA进行杂交捕获，该18个基因分别为STAT3、DDR2、STAT3、ERBB3、SOD2、RAF1、ERBB4、AKT1、SLIT1、NTRK1、DDR2、KEAP1、NOTCH1、TSC2、JAK2、JAK2、EGFR和ATM；S3.使用测序仪进行测序，对测序数据进行数据分析，分析每个基因的累计突变频率，使用逻辑回归的模型判断样本的良恶性。进一步地，S1中，对cfDNA进行文库构建，具体包括如下步骤：S11.提取外周血血浆中的游离的DNA，并对提取的cfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，片段大小峰值位于40-170bp，DNA起始量在5-25ng之间；S12.然后依次对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3′末端加T、连接接头、PCR扩增富集，S13.最后对所述PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化，即获得cfDNA文库。进一步地，S12的样品纯化以及S13的PCR产物纯化都采用磁珠吸附法进行。进一步地，S2中捕获探针的3′端具有生物素标记，基因捕获探针采用覆瓦式探针，探针长度120bp。进一步地，S2中，在杂交捕获中，按照一个探针捕获10-12个cfDNA文库的用量添加捕获探针。进一步地，S3中，使用第二代高通量测序仪IlluminaNextSeq550对样本进行测序，18个基因目标区域cfDNA测序深度达到10000X。进一步地，S3中，数据分析包括使用afterQC去除低质量数据，bwa进行数据比对，使用dedup软件去除PCR重复，samtools+VarScan2进行变异检测，然后使用MrBam统计每个变异位点比对唯一读段数量，过滤唯一读段小于2的变异，使用正常人baseline数据库过滤正常人中出现的体细胞变异。进一步地，S3中，使用逻辑回归的模型是通过公式log(p/(1-p))＝b0+b1*x1+b2*x2+…+bn*xn计算，得到在给定基因突变频率(x1,x2,…xn)时，样本为恶性的概率p；当p>0.5时判定样本为恶性，其余判定样本为良性。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过对肺结节患者外周血cfDNA进行文库构建，并采用肺癌相关18个基因捕获探针对cfDNA进行杂交捕获，然后上机测序，分析每个基因的累计突变频率，使用逻辑回归的模型判断样本的良恶性，从而能够高灵敏度、高特异性的区分肺部结节患者的良恶性，避免了人工读取CT影像学的经验错误，避免了肺癌的漏检以及良性结节患者穿刺或者手术取样活检的痛苦。附图说明图1为一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法的流程图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步阐述，但本专利技术的保护范围并不局限于此。实施例1结合图1所示，一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其是使用cfDNA多基因变异结合机器学习来判定，包括如下步骤：1.对84例肺结节患者样本(48例恶性，36例良性)外周血进行处理，提取外周血血浆中的游离的DNA，cfDNA提取外周血中的cfDNA含量很低，因此保证血浆cfDNA提取质量至关重要。cfDNA提取方案详细步骤如下：外周血cfDNA的提取纯化，通常采用10mL全血，在获得血液的3h内分离血浆，将全血4℃1600g离心10min，收集上清至5mL离心管中；再将上清4℃，16000g离心10min，收集上清血浆转移至5mL离心管中。分离好的血浆最好是立即提取DNA，这样是为了保证血浆中DNA的完整性。提取血浆中游离DNA的试剂盒有很多种，本例具体采用QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取试剂盒，提取步骤参考试剂盒说明书。然后对提取的cfDNA进行质量控制(即质控)，测定其片段大小和浓度。cfDNA质控采用Agilent2100检测提取的cfDNA的片段大小，采用q-PCR测定提取的cfDNA的浓度。片段大小峰值位于40-170bp，DNA起始量在5-25ng之间。然后依次对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3′末端加T、连接接头、PCR扩增富集，最后对所述PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化即获得cfDNA文库。更具体的cfDNA文库构建：cfDNA文库的构建可以采用市面上多种产品实现，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其特征在于，其是使用cfDNA多基因变异结合机器学习来判定，包括如下步骤：S1.对肺结节患者外周血cfDNA进行文库构建；S2.采用肺癌相关18个基因捕获探针对cfDNA进行杂交捕获，该18个基因分别为STAT3、DDR2、STAT3、ERBB3、SOD2、RAF1、ERBB4、AKT1、SLIT1、NTRK1、DDR2、KEAP1、NOTCH1、TSC2、JAK2、JAK2、EGFR和ATM；S3.使用测序仪进行测序，对测序数据进行数据分析，分析每个基因的累计突变频率，使用逻辑回归的模型判断样本的良恶性。

【技术特征摘要】
1.一种通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其特征在于，其是使用cfDNA多基因变异结合机器学习来判定，包括如下步骤：S1.对肺结节患者外周血cfDNA进行文库构建；S2.采用肺癌相关18个基因捕获探针对cfDNA进行杂交捕获，该18个基因分别为STAT3、DDR2、STAT3、ERBB3、SOD2、RAF1、ERBB4、AKT1、SLIT1、NTRK1、DDR2、KEAP1、NOTCH1、TSC2、JAK2、JAK2、EGFR和ATM；S3.使用测序仪进行测序，对测序数据进行数据分析，分析每个基因的累计突变频率，使用逻辑回归的模型判断样本的良恶性。2.根据权利要求1所述的通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其特征在于，S1中，对cfDNA进行文库构建，具体包括如下步骤：S11.提取外周血血浆中的游离的DNA，并对提取的cfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，片段大小峰值位于40-170bp，DNA起始量在5-25ng之间；S12.然后依次对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3′末端加T、连接接头、PCR扩增富集，S13.最后对所述PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化，即获得cfDNA文库。3.根据权利要求2所述的通过血液样本判断肺结节良恶性的方法，其特征在于，S12的样品纯化以及S13的PCR产物纯化都采用磁珠吸附法进行。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：温媛，周衍庆，陈实富，张实唯，
申请(专利权)人：深圳市海普洛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44