用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法。其包括如下引物和探针：上游引物SEQ ID NO：1：5’‑TAAAGCACCCAGGAAGCAAC‑3’；下游引物SEQ ID NO：2：5’‑CAAGAGAGACTTTGTCCCATTTTT‑3’；野生型探针SEQ ID NO：3:5’‑TTCACCCCTCCAGTAGA‑3’；突变型探针SEQ ID NO：4:5’‑TTCACCCATCCAGTAGA‑3’。其可检测到极低含量的突变；检测成本低，适宜于临床开展；相较于二代高通量测序，本发明专利技术特异性针对H3F3A G34W位点的检测，特异性高，成本较低。

【技术实现步骤摘要】
用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法
本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法。
技术介绍
骨巨细胞瘤是常见的侵袭性原发骨肿瘤，其高发于青壮年，而且复发率高，5-50％的患者手术后会复发(SalernoM,AvnetS,AlberghiniM,GiuntiA,BaldiniN.Histogeneticcharacterizationofgiantcelltumorofbone.ClinOrthopRelatRes2008；466:2081-91)。2013年，BehjatiS等在Naturegenetics上报道骨巨细胞瘤和软骨细胞瘤分别是由H3F3A和H3F3B基因的不同突变造成的(BehjatiS,TarpeyPS,PresneauN,etal.DistinctH3F3AandH3F3Bdrivermutationsdefinechondroblastomaandgiantcelltumorofbone.Naturegenetics2013；45:1479-82)。另外，据文献(PresneauN,BaumhoerD,BehjatiS,etal.DiagnosticvalueofH3F3Amutationsingiantcelltumourofbonecomparedtoosteoclast-richmimics.JPatholClinRes2015；1:113-23)报道，92％的骨巨细胞瘤(49/53)由H3F3AG34W突变导致，而95％(73/77)的软骨母细胞瘤由H3F3BK36M突变导致。另外一项研究(ClevenAH,HockerS,Briaire-deBruijnI,SzuhaiK,Cleton-JansenAM,BoveeJV.MutationAnalysisofH3F3AandH3F3BasaDiagnosticToolforGiantCellTumorofBoneandChondroblastoma.AmJSurgPathol2015；39:1576-83)也证实了93％(85/91)的骨巨细胞瘤是由H3F3AG34W突变导致。这两项研究中均采用全基因组测序或者全外显子组测序的技术，高通量测序技术能够同时对人体的所有基因进行大规模平行测序，适用于未知基因突变的寻找。但是，这些高通量测序技术成本高，耗时耗力，数据分析周期长，难以应用于临床检测，特别是对于骨巨细胞瘤这种已经明确了的突变基因和位点的疾病。随后的另一项研究(PekinD,SkhiriY,BaretJC,etal.Quantitativeandsensitivedetectionofraremutationsusingdroplet-basedmicrofluidics.Labonachip2011；11:2156-66)采用了一代Sanger测序技术对骨巨细胞瘤进行H3F3A突变分析，其突变检出率却较低(69％)。分析其原因可能主要在于：1.骨巨细胞瘤由肿瘤细胞和大量反应细胞密切混合在一起构成，在肿瘤细胞比例较低时就难以用一代Sanger测序技术检出；2.Sanger测序是针对所有DNA样品的同时测序，没法实现对单个DNA分子的并行测序，因此测序结果经常出现双峰、杂峰等，难以判读结果；3.引物设计可能不太恰当。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物、探针、设备及方法，其可检测到极低含量的突变；检测成本低，适宜于临床开展；相较于二代高通量测序，本专利技术特异性针对H3F3AG34W位点的检测，特异性高，成本较低。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一方面，提供一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物及探针，其包括如下引物和探针：上游引物SEQIDNO：1：5’-TAAAGCACCCAGGAAGCAAC-3’；下游引物SEQIDNO：2：5’-CAAGAGAGACTTTGTCCCATTTTT-3’，；野生型探针SEQIDNO：3:5’-TTCACCCCTCCAGTAGA-3’；突变型探针SEQIDNO：4:5’-TTCACCCATCCAGTAGA-3；或包括：与所述上游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列。优选的，所述G34W位点突变为缺失/插入/替换突变。优选的，所述野生型探针和突变型探针均包括荧光基团以及淬灭基团。优选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy3以及Cy5中的一种；所述淬灭基团选自BQH1、BQH2、MGB以及TAMARA中的一种。优选的，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列。优选的，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有90％以上同源性的核苷酸序列。另一方面，还提供一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的试剂盒，其包括上述引物和探针。另一方面，还提供一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的方法，其包括如下步骤：S1、准备如权利要求1-6任一项所述的上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针；S2、从待测样品中提取待检测的DNA模板；S3、配制对待检测的DNA模板进行荧光PCR扩增的反应体系，并进行PCR扩增，且所述PCR扩增的反应条件为：92-96℃预变性5min，共1个循环；92-96℃变性8-15s，共50个循环；55-65℃延伸40s，共50个循环；98℃10min，共1个循环；以及S4、检测荧光PCR扩增过程后的荧光信号变化，并根据所述荧光信号判断是否发生有基因突变，和/或，确定发生基因突变的DNA模板的数量和/或含量。优选的，所述待测样品包括：手术切除组织、石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、血浆以及血清中的一种或几种。另一方面，还提供一种用于检测基因突变的设备，其包括：PCR反应体系制备单元，其用于将上述上游引物、下游引物、野生型探针以及突变型探针和待检测的DNA模板、PCR预混液进行混合，以制备数字PCR混合液；数字PCR反应单元，其用于利用所述数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，且针对所述PCR微反应液滴进行PCR扩增；以及数据处理单元，其用于对PCR扩增产物的信号进行收集，并根据所述信号判断是否发生有基因突变，和/或，确定发生基因突变的DNA模板的数量和/或含量。本专利技术技术方案的有益效果在于：1)灵敏度高，可检测到极低含量的突变，避免一代测序中容易误诊漏诊的缺陷；2)检测成本低，适宜于临床开展；相较于二代高通量测序，本专利技术特异性针对H3F3AG34W位点的检测，特异性高，成本较低。附图说明下面将结合附图及实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物及探针，其特征在于，包括如下引物和探针：上游引物SEQ ID NO：1：5’‑TAAAGCACCCAGGAAGCAAC‑3’；下游引物SEQ ID NO：2：5’‑CAAGAGAGACTTTGTCCCATTTTT‑3’，；野生型探针SEQ ID NO：3:5’‑TTCACCCCTCCAGTAGA‑3’；突变型探针SEQ ID NO：4:5’‑TTCACCCATCCAGTAGA‑3；或包括：与所述上游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人H3F3A基因G34W位点突变的引物及探针，其特征在于，包括如下引物和探针：上游引物SEQIDNO：1：5’-TAAAGCACCCAGGAAGCAAC-3’；下游引物SEQIDNO：2：5’-CAAGAGAGACTTTGTCCCATTTTT-3’，；野生型探针SEQIDNO：3:5’-TTCACCCCTCCAGTAGA-3’；突变型探针SEQIDNO：4:5’-TTCACCCATCCAGTAGA-3；或包括：与所述上游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有60％以上同源性的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述G34W位点突变为缺失/插入/替换突变。3.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述野生型探针和突变型探针均包括荧光基团以及淬灭基团。4.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy3以及Cy5中的一种；所述淬灭基团选自BQH1、BQH2、MGB以及TAMARA中的一种。5.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列；与所述突变型探针具有80％以上同源性的核苷酸序列。6.如权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述引物和探针包括：与所述上游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述下游引物具有90％以上同源性的核苷酸序列；与所述野生型探针具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨邵敏，刘小旦，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11