芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用制造技术

本发明专利技术涉及芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用。本发明专利技术首次公开了芽孢形成相关基因sigmaF在产酶方面的作用，通过插入式失活的方式，将sigmaF部分基因片段与Cm

【技术实现步骤摘要】
芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用
本专利技术涉及芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，属于分子生物学
及酶工程领域。
技术介绍
克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)是常用工业生产菌株，在发酵生产过程中能产生蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶类。其中，纤维素酶(β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是一类能够降解纤维素，使之生成纤维素二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，可以将纤维素物质水解成葡萄糖。纤维素酶在食品、饲料、纺织、造纸等行业有广泛应用，近年来，在生物质的综合利用、生物能源清洁生产等方面的作用更是备受关注。为了获得高酶活力，不同的分子生物学手段应用于基因工程菌的构建，以通过多样性育种手段进一步提高酶活力，降低酶的规模化生产成本和使用成本。中国专利文献CN106191013A(申请号201610853941.9)公开了一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，该专利技术通过构建同源重组质粒，并转化巨大芽孢杆菌ATCC14581，得到表达纤维素酶的巨大芽孢杆菌工程菌，通过调节外界的温度或酸度可以定向的控制该巨大芽孢杆菌纤维素外切酶或内切酶的表达。中国专利文献CN102766615A(申请号201210256710.1)公开了一种利用芽孢杆菌制备纤维素酶的方法，其包括步骤：以芽孢杆菌为生产菌株，经过斜面培养、振荡培养、发酵培养而得，其中发酵培养的培养基包括质量含量的淀粉0.5-2％、豆饼粉1-5％、豆饼粉水解液8-12％、麸皮0.3-0.8％、无机盐1-2％、消泡剂0-0.3％，该方法得到的是在pH中性及碱性条件下高活性的纤维素酶，在水洗酶应用方面明显优于酸性纤维素酶。但是芽孢形成相关基因与产纤维素酶的关系尚没有明确报道，有研究发现，芽孢形成相关基因不仅影响芽孢的形成，对于菌株的结构、生长、代谢产物生成等也有调节作用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，选择性敲除芽孢形成相关基因sigmaF，构建芽孢缺失菌，可有效提高菌株纤维素酶的酶活。专利技术概述：本专利技术选择性敲除芽孢形成相关基因sigmaF，将克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF与Cmr片段进行重叠连接，通过酶切、浓缩后转化克劳氏芽孢杆菌，使芽孢形成相关基因sigmaF失活，构建克劳氏芽孢杆菌芽孢缺失菌，细胞代谢发生变化，菌株纤维素酶酶活显著提高，其酶活为出发菌株的3.5倍左右。专利技术详述：本专利技术的技术方案如下：芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述产酶为产纤维素酶，纤维素酶的酶活为出发菌株的3～4倍。根据本专利技术优选的，所述芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，步骤如下：(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)以pHT01质粒为模板，经PCR扩增获得Cmr片段，所述Cmr片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(3)采用重叠PCR技术将步骤(1)获得的基因sigmaF与步骤(2)获得的Cmr片段进行融合，制得融合基因sigmaF-Cmr，所述融合基因sigmaF-Cmr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(4)将步骤(3)制得的融合基因sigmaF-Cmr经酶切后，浓缩，转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，经筛选得阳性重组菌，即可应用于产酶。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：sigmaF-F：CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG，sigmaF-R：GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAATGAGTGGTCGGCAAT；PCR扩增体系如下，总体积50μL：2×HiFi-PCRMaster25μL，上游引物sigmaF-F2.5μL，下游引物sigmaF-R2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA2.5μL，ddH2O17.5μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min15s，共30个循环；72℃继续延伸10min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：Cmr-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC，Cmr-R：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG；PCR扩增体系如下，总体积50μL：2×HiFi-PCRMaster25μL，上游引物Cmr-F2.5μL，下游引物Cmr-R2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH2O17.5μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的扩增引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：sigmaF-F：CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG，Cmr-R：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG；第一轮重叠PCR扩增体系如下，总体积25μL：2×HiFi-PCRMaster12.5μL，基因sigmaF2μL，Cmr片段2μL，ddH2O8.5μL；第一轮重叠PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，5个循环；72℃继续延伸10min。第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR扩增体系的基础上补加如下试剂：2×HiFi-PCRMaster12.5μL，上游引物sigmaF-F1μL，下游引物Cmr-R1μL，ddH2O10.5μL；第二轮重叠PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环；72℃继续延伸10min。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，酶切的反应体系如下，总体积40μL：重叠PCR产物20μL，10×KBuffer4μL，BamHⅠ内切酶2μL，ddH2O14μL；酶切条件为：37℃，1.5h。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，浓缩后的融合基因sigmaF-Cmr的浓度为300～500ng/μL。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，劳氏芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落，37℃，220r/min培养至菌体浓度OD600＝0.9～1.0，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌EP管，制得克劳氏芽孢杆菌感受态细胞。进一步优选的，所述电转缓冲液的组分如下：质量百分比为9.1％的山梨醇，质量百分比为9.1％的甘露醇，体积百分比为10％的甘油，余量水。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，步骤如下：将经酶切浓缩后的融合基因sigmaF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，其特征在于，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，其特征在于，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，其特征在于，所述产酶为产纤维素酶，纤维素酶的酶活为出发菌株的3～4倍。3.如权利要求1所述的芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，其特征在于，步骤如下：(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)以pHT01质粒为模板，经PCR扩增获得Cmr片段，所述Cmr片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(3)采用重叠PCR技术将步骤(1)获得的基因sigmaF与步骤(2)获得的Cmr片段进行融合，制得融合基因sigmaF-Cmr，所述融合基因sigmaF-Cmr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(4)将步骤(3)制得的融合基因sigmaF-Cmr经酶切后，浓缩，转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，经筛选得阳性重组菌，即可应用于产酶；优选的，所述浓缩后的融合基因sigmaF-Cmr的浓度为300～500ng/μL。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：sigmaF-F：CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG，sigmaF-R：GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAATGAGTGGTCGGCAAT；PCR扩增体系如下，总体积50μL：2×HiFi-PCRMaster25μL，上游引物sigmaF-F2.5μL，下游引物sigmaF-R2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA2.5μL，ddH2O17.5μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min15s，共30个循环；72℃继续延伸10min。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：Cmr-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC，Cmr-R：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG；PCR扩增体系如下，总体积50μL：2×HiFi-PCRMaster25μL，上游引物Cmr-F2.5μL，下游引物Cmr-R2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH2O17.5μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖静，王瑞明，原梨萍，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37