体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种体外检测MUSK‑Ab和LRP4‑Ab的方法及试剂盒。该方法包括以下步骤：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒和/或pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒；向转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX‑100进行封闭、通透2～3h；取待测血清，添加封闭、通透后的pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞中，24～28℃下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa Fluor

Method and kit for detection of MUSK-Ab and LRP4-Ab in vitro

The invention relates to a method and a kit for in vitro detection of MUSK_Ab and LRP4_Ab. The method consists of the following steps: taking 293T cells and transfecting 293T cells into pCMV6 AC GFP MuSK recombinant plasmid and/or pCMV6 AC GFP LRP4 recombinant plasmid; transfecting pCMV6 AC GFP MuSK recombinant plasmid into transfected cells and/or transfecting pCMV6 AC GFP LRP4 recombinant plasmid after adding polyformaldehyde to the transfected cells and fixing them with polyformaldehyde 30 minutes; bovine serum albumin and Triton X 100 were added after washing with phosphate buffer solution for closure and permeability for 2-3 hours; the serum was taken and the transfected cells and/or transfected cells with closed and permeable pCMV6 AC GFP MuSK recombinant plasmid and/or closed and permeable pCMV6 AC GFP LRP4 recombinant plasmid were added at 24-28 C. After incubation for 45 minutes to 2 hours, the phosphate buffer was washed and Alexa Fluor was added.

【技术实现步骤摘要】
体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒
本专利技术属于MUSK-Ab和LRP4-Ab测定
，具体涉及一种体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法及试剂盒。
技术介绍
重症肌无力(MyastheniaGravis，MG)是一种细胞依赖的、补体参与的神经肌肉接头处的自身免疫性疾病。其发病率约为1/4000-5000，所有年龄组均可受累，有两个发病高峰，女性发病高峰为20-40岁，男性发病高峰为50-70岁，临床特点包括肌肉无力和易疲劳，肌无力症状在活动后加重，休息或睡眠后缓解。早期易累及颅神经，眼外肌受累最常见，眼睑下垂和复视是常见主诉。约15％MG患者伴有胸腺瘤，70％MG患者伴有胸腺增生。MG患者血清中可以检测到多种自身抗体，约85％MG患者血清中乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)阳性，称为血清反应阳性MG(SPMG)，若MG患者血清种未检测到AChR-Ab的，则称为血清反应阴性MG(SNMG)，在此类患者血清中可以通常可存在其它类型抗体如肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)是近年来发现的新的MG自身抗体，可与上述两种自身抗体同时存在，或单独致病。因此，这三种抗体联合检测将大幅提高MG诊断的灵敏度和特异性，对重症肌无力的诊断、治疗以及预后具有重要指导意义。目前，AChR-Ab、MuSK-Ab两种MG自身抗体检测，主要采用价格昂贵的试剂，包括英国RSR公司和德国欧蒙公司的产品。采用的方法是放射性免疫技术(RIA)和/或酶联免疫方法(ELISA)。放射性免疫技术(RIA)灵敏度高，试验周期较短，但试剂的有效期短，约为1个月，不适合像中国这样一个地域辽阔国家的，而且还存在放射性污染。酶联免疫方法(ELISA)有效期长，灵敏度高和特异性强，但因为使用强酸终止液污染环境，此外酶联免疫方法因为需要依赖价格昂贵的试剂盒使得测试成本较高。免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体或抗原作为探针检查细胞内或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的组织或细胞，从而确定抗原或抗体的性质和定位。现有技术中没有采用细胞免疫荧光法测定MuSK-Ab的技术方案。如果要准确诊断MG，需对影响MG的多个抗体，包括LRP4-Ab和MuSK-Ab等进行联合检测。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的方法，该方法可准确测出血清中是否存在MUSK-Ab，且检测成本较低。本专利技术的第二个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的方法，该方法可准确、测出血清中是否存在LRP4-Ab，且检测成本较低。本专利技术的第三个目的是提供一种体外检测MUSK-Ab的试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供一种体外检测LRP4-Ab的试剂盒。为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，包括以下步骤：1)细胞转染重组质粒：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和/或pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒，得到转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；2)转染细胞的固定与保存：向步骤2)中的转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤之后添加牛血清白和TritonX-100进行封闭、通透2～3h，得到封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；3)免疫荧光测定：取待测血清，添加至步骤2)中的封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞中，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入AlexaFluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育45min～2h，所述室温是指18～25℃，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。进一步地，所述细胞转染重组质粒过程中使用转染试剂进行转染，转染后置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24～60h，之后检测转染效果，挑选转染成功的细胞。进一步地，将步骤2)中所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞在3～5℃条件下保存3～4周后进行免疫荧光测定。进一步地，对转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞进行固定的温度是3～5℃，封闭和通透的温度为35～38℃。体外检测MUSK-Ab的试剂盒，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。体外检测LRP4-Ab的试剂盒，包括封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞，所述封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞由权利要求1的步骤2)中所述的转染细胞的固定与保存制备所得。转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和人肌肉特异性酪氨酸激酶蛋白(MuSK蛋白)，转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4蛋白)。MuSK蛋白能与待测血清中的抗MuSK抗体特异性结合，LRP4蛋白能与待测血清中的LRP4抗体特异性结合。如果待测血清为阳性，则待测血清中的MuSK-Ab和LRP4-Ab能与AlexaFluorTM568标记的羊抗人IgG，即AlexaFluorTM568标记的羊抗人IgG结合。在荧光显微镜的激发光下，用蓝色激发光激发GFP发绿色荧光，用绿色激发光激发AlexaFluorTM568标记的羊抗人IgG发红色荧光，当两者Merge后呈黄色。如果待测血清为阴性，待测血清中不存在MuSK-Ab和LRP4-Ab，则只能看到蓝色激发光激发GFP发绿色荧光而不能看到红色荧光。本专利技术的有益效果：本专利技术的体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，包括细胞转染重组质粒、转染细胞的固定与保存以及免疫荧光测定等步骤，所使用试剂均为常规试剂，不需要依赖价格昂贵的试剂盒，检测成本较低。使用的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒可直接购买或自行构建。此外，转染细胞通过封闭和通透进行固定后，可保存3到4周，保存时间较长，可长期使用，不需要随时制备转染细胞，节省成本，节约检测时间。本专利技术的体外检测MUSK-Ab和LRP4-A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.体外检测MUSK‑Ab和LRP4‑Ab的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞转染重组质粒：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒和/或pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒，得到转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞；2)转染细胞的固定与保存：向步骤2)中的转染pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX‑100进行封闭、通透2～3h，得到封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞；3)免疫荧光测定：取待测血清，添加至步骤2)中的封闭、通透后的pCMV6‑AC‑GFP‑MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6‑AC‑GFP‑LRP4重组质粒的转染细胞中，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入Alexa FluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。...

【技术特征摘要】
1.体外检测MUSK-Ab和LRP4-Ab的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞转染重组质粒：取293T细胞，将293T细胞转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒和/或pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒，得到转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；2)转染细胞的固定与保存：向步骤2)中的转染pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或转染pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞添加多聚甲醛后固定15～30min；磷酸盐缓冲液洗涤之后添加牛血清白蛋白和TritonX-100进行封闭、通透2～3h，得到封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞；3)免疫荧光测定：取待测血清，添加至步骤2)中的封闭、通透后的pCMV6-AC-GFP-MuSK重组质粒的转染细胞和/或封闭、通透的pCMV6-AC-GFP-LRP4重组质粒的转染细胞中，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤之后加入AlexaFluorTM568标记的羊抗人IgG，室温下孵育45min～2h，磷酸盐缓冲液洗涤后使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光激发，观察并拍照记录。2.根据权利要求1所述的体外检测MUSK-Ab和LR...

【专利技术属性】
技术研发人员：高峰，韩姣姣，李明强，张迎娜，张婧，赵雪，吕杰，方华，
申请(专利权)人：河南省医药科学研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41