用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒。本发明专利技术发现了与慢性牙周炎诊断及中重度病程分类相关的分子标志物，包括p19mRNA、p40mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA，并且定量检测分子标志物及其组合，可用于诊断慢性牙周炎，故有望将上述标志物用于制备慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价试剂盒中。

Markers and kits for screening, diagnosis and therapeutic evaluation of chronic periodontitis

The invention discloses a marker and a kit for screening, diagnosing and evaluating the curative effect of chronic periodontitis. The invention discovers molecular markers related to the diagnosis of chronic periodontitis and the classification of moderate and severe course of disease, including p19, p40, p35 and EBI3, and quantitatively detects molecular markers and their combinations, which can be used for the diagnosis of chronic periodontitis. Therefore, the above markers are expected to be used for the preparation of screening, diagnosis and curative effect of chronic periodontitis. In the evaluation kit.

【技术实现步骤摘要】
用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，更具体地，涉及慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒。
技术介绍
牙周炎是牙周细菌感染，导致牙周附着组织和牙槽骨破坏，而引起的慢性非特异性感染性疾病。目前在世界各地范围内牙周炎均有较高的发病率和患病率，全世界5～20％成年人患有重度牙周炎，而儿童及未成年人牙周炎类型多样，主要以侵袭性牙周炎，慢性牙周炎(Chronicperiodontitis，CP)及各种系统性疾病并发的牙周炎为主。牙周炎危害极大，导致牙周组织炎症、牙周袋形成，进行性附着丧失和牙槽骨质吸收，最终发生牙齿松动导致牙拔除。目前临床上对牙周炎严重程度的评价指标主要有：牙周探诊深度(PD)、龈沟出血指数(SBI)和X线等，然而这些指标均只能代表单一病变的最终结果，并不能及时准确地表明牙周炎的发生、发展变化。在牙周炎的发生、发展过程中，除细菌微生物感染外，宿主的免疫调节作用也尤为重要，尤其是细胞因子参与的免疫调节作用。细胞因子是由活化的免疫细胞或其它细胞分泌的有生物学活性的蛋白质，通过与靶细胞受体结合后，激活细胞信号通路，从而调节细胞生理功能，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。因此，细胞因子在促进牙龈组织炎症，加速牙周结缔组织的破坏和牙槽骨的吸收中具有重要作用。所以，寻找有效的、重要的牙周炎发生发展相关细胞因子是阐述牙周炎发病机理，研究早期诊断和治疗靶点亟需解决的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物，所述标志物包括p19、p40、p35、EBI3中至少一种，所述标志物包括标志物的DNA、mRNA或编码的蛋白质。优选的，所述标志物由p19mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA和/或p40mRNA构成。优选的，p19mRNA相对表达量≥0.9，p35mRNA相对表达量≥0.8，EBI3mRNA相对表达量≥2.0，和/或p40mRNA相对表达量≥0.9，则判定为慢性牙周炎阳性。优选的，标志物在离体的外周血、牙龈组织或龈沟液中检测。能够定量检测标志物的试剂在制备慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价试剂盒中的应用，所述标志物包括p19、p40、p35、EBI3中至少一种，所述标志物包括标志物的DNA、mRNA或编码的蛋白质。优选的，所述标志物由p19mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA和/或p40mRNA构成。进一步优选的，p19mRNA相对表达量≥0.9，p35mRNA相对表达量≥0.8，EBI3mRNA相对表达量≥2.0，和/或p40mRNA相对表达量≥0.9，则判定为慢性牙周炎阳性。优选的，能够定量检测标志物的试剂可选自引物、抗体或芯片。进一步优选的，定量检测标志物的引物为：定量检测P19mRNA的引物对：F：5’-CAGCGCCCCCTTCTCCGTTC-3’；R：5’-CTCAGGCCACGCAGCTGCTT-3’；定量检测P40mRNA的引物对：F：5’-GAAGTACACAGTGGAGTGTCAGG-3’；R：5’-GGTTTGATGATGTCCCTGATGAAG-3’；定量检测P35mRNA的引物对：F：5’-ACACCAAGCCCAGGAATGTTC-3’；R：5’-TGGCCTTCTGAAGCGTGTTG-3’；定量检测EBI3mRNA的引物对：F：5’-AGAGCACATCATCAAGCCCGAC-3’；R：5’-TCCCTGACGCTTGTAAGCGCATC-3’。优选的，标志物在离体的外周血、牙龈组织或龈沟液中检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术发现了与慢性牙周炎诊断及中重度病程分类相关的分子标志物，包括p19mRNA、p40mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA，并且定量检测分子标志物及其组合，可用于诊断慢性牙周炎，故有望将上述标志物用于制备慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价试剂盒中。附图说明图1是慢性牙周炎患者(CP)和健康志愿者(HV)牙龈组织中细胞因子亚基mRNA相对表达量，图中，A：p19基因；B：p40基因；C：p35基因；D：EBI3基因；图2是中度(moderate)和重度(severe)慢性牙周炎患者(CP)牙龈组织中细胞因子亚基mRNA相对表达量，图中，A：p19基因；B：p40基因；C：p35基因；D：EBI3基因。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。本专利技术未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作或按照制造厂商所建议的条件；实施例中为注明具体来源的试剂均为常规市售产品；本专利技术的组织来源由暨南大学附属东莞医院和广东医科大学附属龙华中心医院提供。实施例1、慢性牙周炎患者的p19mRNA、p40mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA相对表达量显著高于健康志愿者组织来源：口腔科或住院部牙周炎患者拔除的无保留价值牙周围的牙龈组织30例牙周炎患者组(其中，重度慢性牙周炎13例，中度慢性牙周炎17例，中度牙周炎拔除的患牙为种植或修复需要而拔除)，30例阻生牙拔除患者的正常牙龈组织为健康志愿者组，牙周炎患者组与健康志愿者组在性别、年龄、白细胞含量、抗牙龈卟啉单胞菌的IgG抗体含量上无显著差异。Real-timePCR检测慢性牙周炎患者牙龈组织和健康志愿者牙龈组织中p19mRNA、p40mRNA、p35mRNA和EBI3mRNA相对表达量，具体步骤如下：1、RNA的提取利用试剂盒从组织中提取RNA，用手术刀切取组织或冰冻组织，用手术刀刀尖划碎组织成浆状，再转移到一个1.5mL的EP管中；1.5mL的EP管中加入20μL蛋白酶K贮存液，再加入180μL56℃的BufferAT，在漩涡振荡器上振荡数秒；放在56℃水浴箱中10min，期间不断间隔漩涡振荡数次；随后200μLBufferSL加入水浴后的EP管中，振荡15s使其混匀；离心管置于70℃的水浴箱中水浴10min；吸取200μL无水乙醇加入EP管中，混合均匀；吸取混合后的溶液加入到核酸纯化柱中，放入离心机，12000rpm离心30秒；弃管中的滤液，将核酸纯化柱放回到试剂盒中原有的2mL离心管中，再加入500μLBufferWA，放入离心机，12000rpm离心30秒；同样，丢弃离心管中离心后的滤液，再将600μLBufferWB加入核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rpm离心30秒；重复操作一次；最后，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，加入100～200μL56℃温育的BufferTE,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30s；弃纯化柱，洗脱的RNA储存于-20℃备用，保存时间不要超过1周；吸取1μL样品RNA溶液，于微量核酸蛋白分析仪MerintonSM4000分光光度计测定260nm及280nm的吸光度，得到RNA浓度及质量。2、逆转录及Real-timePCR对提取的RNA样品进行逆转录，操作步骤参照TaKaRa公司PrimeScriptTMreagentKit试剂盒说明书进行，获得cDNA；以cDNA为模板，按照SYBRPremixEXTaqTM(TliRNaseHPlus本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物，所述标志物包括p19、p40、p35、EBI3中至少一种，所述标志物包括标志物的DNA、mRNA或编码的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物，所述标志物包括p19、p40、p35、EBI3中至少一种，所述标志物包括标志物的DNA、mRNA或编码的蛋白质。2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于：所述标志物由p19mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA和/或p40mRNA构成。3.根据权利要求2所述的标志物，其特征在于：p19mRNA相对表达量≥0.9，p35mRNA相对表达量≥0.8，EBI3mRNA相对表达量≥2.0，和/或p40mRNA相对表达量≥0.9，则判定为慢性牙周炎阳性。4.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于：标志物在离体的外周血、牙龈组织或龈沟液中检测。5.能够定量检测标志物的试剂在制备慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价试剂盒中的应用，所述标志物包括p19、p40、p35、EBI3中至少一种，所述标志物包括标志物的DNA、mRNA或编码的蛋白质。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述标志物由p19mRNA、p35mRNA、EBI3mRNA和/或p40mRNA构成。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：p19mRNA相对表达量≥0.9，p35...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾今诚，蔡树玉，梁艳芳，林晓悦，林碧华，
申请(专利权)人：东莞市第五人民医院东莞市太平人民医院，广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44